白植寬，高曉慧，馮 濤

0 引言

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)是一種以肺泡毛細(xì)血管膜受損為特征的異質(zhì)性疾病，由于通透性增加而引起肺水腫增加，并可直接或間接發(fā)生肺部炎癥[1-2]。ALI最常見的直接病因是實質(zhì)性肺部感染(即肺炎)或出血，而間接病因通常是全身性損傷，如敗血癥、創(chuàng)傷或急性腎損傷[2-3]。然而，ALI的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前缺乏有效的治療手段，研究顯示，NADPH氧化酶(NOXs)激活產(chǎn)生的活性氧(ROS)在ALI的發(fā)病過程中起著重要的作用[2,4]。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)可將NADP+還原成NADPH，是調(diào)節(jié)細(xì)胞中氧化還原平衡的關(guān)鍵酶[5]，其不僅提供了NADPH氧化酶的還原當(dāng)量，還減少了ROS。在細(xì)胞產(chǎn)生ROS的酶體系中，研究最多的是NOX2。NOX2主要存在于嗜中性粒細(xì)胞等吞噬細(xì)胞中，在氣道上皮細(xì)胞(AECs)也有表達(dá)[4,6]。然而，關(guān)于ALI期間G6PD對AECs中NOX2-衍生的ROS作用的研究還較少。由于ROS在ALI過程中起重要作用，我們推測G6PD活性可能通過NOX2調(diào)節(jié)AECs中ROS的通量發(fā)揮。

脫氫異雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)是一種G6PD抑制劑，研究證實，DHEA及其代謝產(chǎn)物具有抗炎、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)活性[7-8]。因此，我們研究DHEA對LPS誘導(dǎo)的小鼠模型中G6PD活性、NOX2表達(dá)、ROS和AEC中酶抗氧化劑的作用。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 LPS、DHEA(美國Sigma公司)；RNeasy微型試劑盒(德國Qiagen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑、Taqman Universal Mastermix、7500實時PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)；蛋白定量試劑盒、蘇木素-伊紅(HE)染色劑、DCFH-DA檢測試劑盒(南京建成生物)；多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)；多模式微板熒光分光光度計(BMG LabTech)。

1.1.2 實驗動物 實驗中使用在無特定病原體條件下飼養(yǎng)的雄性Balb/c小鼠(鼠齡10～12周，體重25～30 g)，由溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院動物實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 LPS小鼠模型的建立及分組 參照文獻(xiàn)[9]造模方法，應(yīng)用異氟醚輕度麻醉小鼠，每只小鼠于鼻內(nèi)接受單劑量的LPS(50 μg/50 μl)。對照小鼠鼻內(nèi)給予等體積生理鹽水。每只小鼠給予200 μg DHEA，評估G6PD抑制對小鼠LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥的影響。將小鼠隨機(jī)分成4組，每組8只。對照組(Con組)：小鼠僅接受生理鹽水；LPS給藥組(LPS組)：小鼠鼻內(nèi)給予LPS；G6PD抑制劑DHEA和LPS處理組(DHEA+LPS組)：小鼠接受DHEA和鼻內(nèi)LPS。G6PD抑制劑DHEA處理的對照組(DHEA+Con組)：小鼠接受DHEA和鼻內(nèi)生理鹽水。

1.2.3 組織病理學(xué)分析 收集肺組織，10%福爾馬林固定，將石蠟包埋的組織切成5 μm切片，HE染色，通過光學(xué)顯微鏡分析染色。

1.2.4 G6PD及葡萄糖還原酶(GR)活性檢測 使用BioVision試劑盒測量G6PD活性。參照Carlberg等[10]的方法測量氣管上皮細(xì)胞的GR活性，于340 nm波長處測定吸光度。

1.2.5 RT-PCR檢測 用DNA酶處理的RNeasy微型試劑盒提取氣管上皮細(xì)胞的總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書，從0.5 μg總RNA合成cDNA。對于編碼NOX2、SOD1、SOD2、GPx1、G6PD、18S rRNA(核糖體RNA)的基因，使用Taqman Universal Mastermix、cDNA和FAM標(biāo)記的基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR。將每個靶基因的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為內(nèi)源對照基因，并使用2-ΔΔCT分析。

1.2.6 流式細(xì)胞儀 采用免疫染色方法即FITC/APC/PE標(biāo)記的抗體對CD326、NOX2、硝基酪氨酸或SOD1進(jìn)行表面/細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記。在流式細(xì)胞儀上檢測染色的細(xì)胞，并使用FLOW JO分析目的蛋白質(zhì)的表達(dá)。

1.2.7 ROS測量 參照Wang等[11]的方法，使用熒光染料2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA;100 μmol)和多模式微板熒光分光光度計測量上皮細(xì)胞中的ROS。

2 結(jié)果

2.1 G6PD抑制劑對LPS誘導(dǎo)的ALI的影響 LPS可以增強(qiáng)氣道炎癥(總白細(xì)胞/中性粒細(xì)胞、MPO活性和組織病理學(xué))和通透性(BALF總蛋白濃度、肺泡-毛細(xì)血管滲漏)。DHEA可以改善LPS誘導(dǎo)的氣道炎癥和通透性。由于DHEA處理和未處理的對照小鼠之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，未對這個小組進(jìn)一步分析。結(jié)果表明，抑制G6PD可以減弱LPS誘導(dǎo)的氣道炎癥。見圖1。

2.2 LPS對AECs G6PD表達(dá)/活性的影響及DHEA的調(diào)節(jié)作用 由于氧化炎癥(ROS產(chǎn)生及其清除)依賴于G6PD的活性和表達(dá)，因此，我們在ALI期間評估其在AEC中的表達(dá)和活性。結(jié)果表明，在LPS誘導(dǎo)的ALI期間，G6PD顯著升高。然而，G6PD抑制劑DHEA將G6PD的活性歸一化而不影響其表達(dá)。DHEA處理后，AEC中G6PD活性降低，導(dǎo)致LPS誘導(dǎo)的氣道炎癥/通透性降低。見圖2。

2.3 LPS對AECs中NOX2表達(dá)/ROS產(chǎn)生的影響及DHEA的調(diào)控作用 NOX2衍生的ROS產(chǎn)生涉及不同的ALI模型，本研究中，我們探索在小鼠模型中ALI與AECs中G6PD和ROS產(chǎn)生的關(guān)系。RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，LPS在AEC中誘導(dǎo)NOX2增加(圖3A、B、D)。LPS給藥后，AEC中ROS產(chǎn)生顯著增加(圖3C)。G6PD的抑制作用不能改變NOX2的表達(dá)，但是由于NADPH的供應(yīng)受到限制(圖3A～D)，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生減少。結(jié)果表明，在ALI期間，NOX2-衍生的ROS在AEC中升高，可能受G6PD活性的控制。

圖1 DHEA對LPS誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥及相關(guān)參數(shù)的影響

注：A.BAL總白細(xì)胞，B.總BAL中性粒細(xì)胞，C.肺MPO活性，D.BALF蛋白質(zhì)濃度，E.組織病理學(xué)分析，通過HE染色肺組織切片(上圖;100×)和BAL差異白細(xì)胞計數(shù)(下圖;100×)。與LPS組比較，*P<0.05

圖2 LPS對G6PD表達(dá)/活性的影響及G6PD抑制劑DHEA的調(diào)節(jié)作用

圖3 DHEA對LPS誘導(dǎo)的小鼠AECs NOX2表達(dá)和ROS產(chǎn)生的影響

注：A.NOX2 mRNA表達(dá)，B.NOX2+EpCAM+細(xì)胞，C.ROS產(chǎn)生，D.EpCAM+細(xì)胞中NOX2免疫染色的代表性點圖。與LPS組比較，13:45 2018/9/28

2.4 LPS對AECs抗氧化酶的影響及DHEA的調(diào)節(jié)作用 結(jié)果表明，在給予LPS后，AECs中SOD1的mRNA表達(dá)增加(圖4A)，表明ROS主要誘導(dǎo)AECs中的SOD1。在ALI過程中，AECs中SOD1的表達(dá)增加(圖4A、B、E)。上調(diào)SOD1表達(dá)伴隨著硝基酪氨酸表達(dá)的增加，這是LPS處理小鼠中過氧亞硝酸鹽介導(dǎo)的氧化損傷的標(biāo)記(圖4D、F)。用DHEA治療小鼠ALI導(dǎo)致SOD1的正常化和AECs中的硝基酪氨酸表達(dá)(圖4A、B、D、F)。同時，LPS誘導(dǎo)的ALI導(dǎo)致AECs中GR活性降低(圖4C)。結(jié)果表明，上調(diào)SOD1和降低GR活性可能導(dǎo)致ALI期間的氧化損傷和炎癥；G6PD活性的抑制使AECs中LPS誘導(dǎo)的氧化劑-抗氧化劑失衡正常化，提示抑制G6PD的同時，可以抑制ALI相關(guān)氣道炎癥/通透性。

3 討論

NADPH氧化酶、G6PD在調(diào)節(jié)氧化還原平衡以及脂質(zhì)/膽固醇合成中起關(guān)鍵作用。在某些炎癥條件下，由于NADPH供應(yīng)增加，G6PD過表達(dá)，導(dǎo)致NOX2衍生的ROS增加[5,12]。結(jié)果表明，上調(diào)的G6PD可能是組織炎癥的介質(zhì)之一。因此，為了研究G6PD在LPS誘導(dǎo)的氣道炎癥中的病理生理作用，本研究選擇G6PD抑制劑DHEA。結(jié)果顯示，G6PD抑制導(dǎo)致氣道炎癥減少，這可能是由于ALI LPS模型中AECs中NOX2衍生的ROS產(chǎn)生減少。在幾種肺部疾病(如急性呼吸窘迫綜合征、慢性阻塞性肺病、哮喘和囊性纖維化)的發(fā)病中，都涉及ROS的大量產(chǎn)生。ROS可以從常規(guī)來源如嗜中性粒細(xì)胞釋放，通常涉及膜結(jié)合NOX2以及胞質(zhì)成分的激活[6]。NOX2在肺系統(tǒng)中的過度表達(dá)產(chǎn)生ROS，NOX2產(chǎn)生的ROS介導(dǎo)ALI肺組織的氧化損傷[6]。AEC通過NOX2產(chǎn)生ROS[6,13]，然而，在LPS誘導(dǎo)的ALI過程中，G6PD在AECs中調(diào)節(jié)NOX2介導(dǎo)的ROS中作用的研究還較少。

研究表明，G6PD缺乏癥與氧化應(yīng)激和炎癥有關(guān)，其提供還原ROS的還原當(dāng)量[5,14]。本研究結(jié)果表明，AECs中的G6PD活性隨著NOX2介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生增加，可能導(dǎo)致ALI相關(guān)的肺部炎癥。有報道，NADPH氧化酶供應(yīng)增加導(dǎo)致氧化應(yīng)激的G6PD活性增加[15]。LPS誘導(dǎo)的急性腎損傷研究顯示，其可提高G6PD活性，導(dǎo)致腎功能障礙[16]。炎癥信號如IL-1β可以通過增加磷酸戊糖和來自NOX2的ROS引起高血糖相關(guān)的血管損傷[17]。

圖4 DHEA對LPS誘導(dǎo)的小鼠AECs SOD1和硝基酪氨酸表達(dá)的影響

注：A.SOD1 mRNA表達(dá)，B.SOD1+EpCAM+細(xì)胞，C.GR活性，D.硝基酪氨酸+EpCAM+細(xì)胞，E.EpCAM+細(xì)胞中SOD1免疫染色的代表性點圖，E.EpCAM+細(xì)胞。與LPS組比較，*P<0.05

上述研究結(jié)果與本研究一致，有報道，ALI兔模型中G6PD活性增加，但是并沒有研究在ALI過程中G6PD抑制是否有益[18]。本研究結(jié)果顯示，G6PD抑制導(dǎo)致ROS和氣道炎癥減少。Vimercati等[19]研究表明，由于氧化應(yīng)激減少，在衰竭心臟中抑制G6PD有益處。因此，抑制G6PD和ROS減少可能是減輕氣道炎癥的一個因素。本研究中，AECs中ROS和硝基酪氨酸的顯著升高被DHEA阻斷，提示G6PD活性升高加劇了肺部氧化炎癥，這可能是由于NOX2產(chǎn)生了過量ROS。

本研究結(jié)果顯示，總的BALF蛋白質(zhì)濃度下降時，伴隨著ROS生成減少。結(jié)果表明，由于抑制G6PD導(dǎo)致ROS產(chǎn)生減少，可能是造成肺血管通透性總體下降的原因。依賴于LPS處理的小鼠AEC中G6PD活性增強(qiáng)和GR活性降低導(dǎo)致來源于NOX2的ROS產(chǎn)生增加。DHEA抑制G6PD活性導(dǎo)致氣道炎癥/通透性降低，說明G6PD可能是治療干預(yù)的新靶點，可減少NOX2氧化應(yīng)激，改善ALI期間的肺部炎癥。