劉學(xué)飛，張俊梅，徐 龍

0 引言

肝癌是世界范圍內(nèi)的一類常見惡性腫瘤，其在發(fā)展中國家發(fā)病率極高[1]，在我國，肝癌在所有惡性腫瘤的發(fā)病率中位居第二[2]。目前，臨床上治療肝癌的首選方案以肝臟切除手術(shù)和化療相結(jié)合的方式為主[3]，但因為肝癌細胞對化療藥物敏感性差，因此預(yù)后效果不佳[4]。阿霉素是臨床上常用的一類廣譜抗腫瘤藥物，治療肝癌有一定效果，但同時有很強的毒副作用和耐藥性[5]，因而影響了治療效果。姜黃素是提取自姜黃根莖的一種多酚，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[6]。有研究表明，姜黃素可通過對化療藥的增敏作用，聯(lián)合抑制人前列腺癌、喉癌等多種腫瘤細胞，且安全性較高[7-8]。本次實驗通過比較姜黃素和阿霉素聯(lián)用與單用阿霉素對人肝癌PLC/PRF/5細胞增殖、凋亡和化療敏感性的作用效果，為臨床治療肝癌篩選更合理、更有效的化療藥物治療方案提供理論支持。

1 實驗材料

1.1 細胞和動物 人肝癌PLC/PRF/5細胞株(中國科學(xué)院上海細胞所)；裸鼠，雄性，4～6周齡，體重15～20 g(濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司)。

1.2 試劑 姜黃素：南京道斯夫生物科技有限公司；鹽酸阿霉素：浙江海正藥業(yè)股份有限公司；胎牛血清、含雙抗的DMEM、胰蛋白酶：武漢普諾賽生命科技有限公司；PBS緩沖液、MTT溶液：上海奧陸生物科技有限公司；TUNEL熒光一抗：武漢博士德生物工程技術(shù)有限公司；RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol、Marker：北京TRANSGEN生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗儀器 恒溫培養(yǎng)箱；Olympus BX5顯微鏡；低溫離心機；高壓蒸汽滅菌鍋；-80 ℃超低溫冰箱；電子天平儀。

2 實驗方法

2.1 體外實驗

2.1.1 細胞培養(yǎng)與實驗分組 將人肝癌PLC/PRF/5細胞接種于含10%滅活的胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長滿至培養(yǎng)皿約90%時，用0.25%胰蛋白酶進行消化制成單細胞懸液，進行下一步傳代。根據(jù)不同的干預(yù)藥物將細胞分為3組，分別為對照組、阿霉素組(2 μmol)、姜黃素(10 μmol)聯(lián)合阿霉素(2 μmol)組(聯(lián)合組)。

2.1.2 MTT法檢測各實驗組藥物對人肝癌PLC/PRF/5細胞生存抑制情況 ①細胞接種：將單細胞懸液接種于96孔板中，每孔內(nèi)含細胞數(shù)量5×103個/180 μl，將96孔板置于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待細胞貼壁后，按實驗分組向培養(yǎng)孔中加入相應(yīng)藥物。將鹽酸阿霉素和姜黃素分別溶解在DMEM培養(yǎng)液中，并分別稀釋至濃度為0.054 mg/ml和0.018 mg/ml，對照組培養(yǎng)孔中加10 μl空白的DMEM培養(yǎng)液，阿霉素組培養(yǎng)孔中加入10 μl溶有鹽酸阿霉素的DMEM培養(yǎng)液，聯(lián)合組培養(yǎng)孔中加入10 μl阿霉素溶液和10 μl姜黃素溶液，另外增設(shè)只含培養(yǎng)基組，作為空白孔。每組設(shè)置6個平行實驗孔。將其置于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。②MTT法檢測細胞抑制情況：將培養(yǎng)48 h后的96孔板取出，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，孵育4 h后棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，微孔振蕩器震蕩10 min，490 nm波長條件下用紫外-熒光酶標儀測定各培養(yǎng)孔的吸光度值(OD值)，重復(fù)測量3次，根據(jù)公式計算人肝癌PLC/PRF/5細胞在不同藥物作用下的抑制率，存活率(%)=(1-待測孔OD值/對照孔OD值)×100%。

2.1.3 RT-PCR方法檢測人肝癌PLC/PRF/5細胞內(nèi)Caspase-3基因表達 Trizol提取總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取2 μl進行PCR擴增，內(nèi)參為GAPDH，內(nèi)參引物序列：Sense，GTATAATGAGAAGCCAGACCAT；Antisene，ACAGCTTCTCAAGTCT。Caspase-3 mRNA的引物序列：Sense，GTTATCCCTGCTTCACTACT；Antisense，GAGACACTCTGTCCACACC。Caspase-3 mRNA及內(nèi)參擴增條件：94 ℃預(yù)變性2 min，1個循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。取5 μl PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外線投射儀下觀察電泳條帶，分析目的基因Caspase-3 mRNA和參比基因的條帶灰度值。

2.2 體內(nèi)實驗

2.2.1 動物模型建立 本實驗一共15只裸鼠，在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)。取對數(shù)期人肝癌PLC/PRF/5細胞，用0.25%胰蛋白酶進行消化，制成1×108/ml單細胞懸液，每只裸鼠注射2 ml于肩背部皮下，接種后第14天左右，裸鼠背部出現(xiàn)直徑為5 mm左右的腫瘤結(jié)節(jié)，當腫瘤組織體積至少61 mm3時，證明裸鼠人肝癌PLC/PRF/5細胞移植瘤模型建立。腫瘤體積的測量方法是，用游標卡尺分別測量腫瘤的長徑和短徑，按公式計算腫瘤體積，體積(cm2)=(長徑×短徑2)/2。

2.2.2 動物分組及給藥 將實驗動物隨機分為空白對照組(對照組)、阿霉素治療組(阿霉素組)、姜黃素聯(lián)合阿霉素治療組(聯(lián)合組)，每組5只。建模成功(即第14天起)開始給藥，每天1次，持續(xù)給藥10 d。其中阿霉素組裸鼠給予腹腔注射阿霉素溶液1 mg/(kg·只)，聯(lián)合組裸鼠給予腹腔注射阿霉素溶液1 mg/(kg·只)+姜黃素溶液10 mg/(kg·只)，對照組給予等量生理鹽水。每天稱量體重，測量腫瘤組織體積，觀察實驗動物飲食及精神狀態(tài)的變化，并加以記錄。

2.2.3 測量腫瘤體積和重量 在開始給藥前(第14天)，量取裸鼠皮下腫瘤組織的長徑和短徑，并計算體積，經(jīng)過10 d的治療后，將裸鼠處死，取出皮下的腫瘤組織，同時計算此時腫瘤組織的體積，并稱取重量。

2.2.4 實驗動物的處死及標本提取 在腫瘤移植后第24天，將所有實驗裸鼠脫頸椎處死。將腫瘤組織剝離，稱量重量，測量體積后，將每個腫瘤分成兩部分，其中一部分固定于10%甲醛溶液中，24 h后用石蠟包埋制成蠟塊，另一部分保存于-80 ℃冰箱。

2.2.5 TUNEL染色檢測腫瘤組織中細胞凋亡情況 參照文獻中實驗步驟[8]，用TUNEL免疫熒光試劑漂染腫瘤石蠟標本切片，用Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡拍照，每個腫瘤組織隨機選取3張切片，每張切片在熒光顯微鏡下隨機選取5個視野，觀察TUNEL陽性細胞數(shù)量在總細胞數(shù)量中所占比例。

3 結(jié)果

3.1 MTT法檢測不同治療藥物對人肝癌PLC/PRF/5細胞增殖的影響 阿霉素組細胞抑制率為27.68%，顯著高于空白對照組的3.96%(P<0.05)；聯(lián)合組細胞抑制率為39.83%，顯著高于阿霉素組(P<0.05)。三組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

3.2 TUNEL免疫熒光法檢測腫瘤組織中凋亡細胞數(shù)量 由圖1可見，阿霉素組TUNEL陽性細胞染色數(shù)量多于對照組，而聯(lián)合組腫瘤細胞的熒光染色數(shù)量最多。在顯微鏡鏡下相同的視野范圍內(nèi)，對照組凋亡的腫瘤細胞數(shù)量為(202.64±11.72)個，阿霉素組凋亡的腫瘤細胞數(shù)量為(289.75±25.37)個，多于對照組(P<0.05)，聯(lián)合組凋亡的腫瘤細胞數(shù)量為(426.93±31.58)個，顯著多于對照組和阿霉素組(P<0.05)。

3.3 RT-PCR檢測腫瘤細胞內(nèi)Caspase-3基因表達情況 對照組條帶相對灰度值為0.132±0.005，阿霉素組條帶相對灰度值(0.386±0.025)高于對照組(P<0.01)，聯(lián)合組條帶灰度值(0.588±0.054)高于阿霉素組(P<0.01)。見圖2。

圖1 體內(nèi)實驗各組腫瘤組織內(nèi)TUNEL陽性細胞數(shù)量比較

圖2 體外實驗各組細胞Caspase-3 mRNA表達情況比較

3.4 三組動物腫瘤體積比較 治療前，三組動物腫瘤體積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=45.82，P>0.05)；各組治療后體積及治療前后體積差之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=67.96，P<0.01；F=63.39，P<0.01)。治療前，阿霉素組腫瘤體積與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療10 d后，阿霉素組腫瘤體積小于對照組(P<0.01)，治療前后體積差小于對照組(P<0.01)。治療前，聯(lián)合組腫瘤體積與對照組、阿霉素組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后，聯(lián)合組腫瘤體積和治療前后體積差均小于阿霉素組(P<0.01)。見表2。

表2 治療前后裸鼠皮下腫瘤體積比較(mm3)

注：與阿霉素組比較，**P<0.01

3.5 三組腫瘤重量比較 三組腫瘤重量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=52.47,P<0.05)。阿霉素組腫瘤組織重量小于對照組(P<0.05)；聯(lián)合組腫瘤組織重量小于阿霉素組(P<0.05)。見表3。

表3 不同治療手段對裸鼠皮下腫瘤重量的影響

注：與阿霉素組比較，**P<0.01

4 討論

肝癌是發(fā)病率、死亡率都很高的一類惡性腫瘤，極大地威脅著人類健康[1-2]。目前，臨床首選的治療方案是手術(shù)聯(lián)合化療，但肝癌細胞對常規(guī)的化療藥物有很強的耐受性，敏感性差，因此，治療效果往往不理想，不能改善患者的治療結(jié)局[3-4]。阿霉素是臨床上一種重要的化療藥物，通過誘導(dǎo)腫瘤細胞的DNA損傷而誘發(fā)其凋亡，能有效抑制多種癌細胞[5]，因為其毒副作用明顯，臨床上往往與其他藥物聯(lián)合使用，以降低對患者的損傷[9]，但肝癌患者對該藥的敏感性較差[5]。姜黃素是一種從植物姜黃中提取的多酚，有研究報道，姜黃素可通過對化療藥的增敏作用聯(lián)合抑制人前列腺癌、喉癌等多種腫瘤細胞，且安全性較高[7-8，10-13]，但其對人肝癌細胞的作用尚未見報道。

癌癥之所以難以治愈，其重要原因之一是癌細胞能夠在機體內(nèi)無限增殖[14]，因此，抑制癌細胞增殖是治療癌癥的關(guān)鍵[15]。本研究通過MTT法，檢測不同干預(yù)藥物對人肝癌PLC/PRF/5細胞增殖的影響，結(jié)果顯示，阿霉素干預(yù)組的細胞抑制率為27.68%，顯著高于對照組，說明阿霉素能抑制人肝癌PLC/PRF/5細胞的存活和增殖，聯(lián)合組細胞抑制率為39.83%，明顯高于阿霉素干預(yù)組，說明姜黃素和阿霉素聯(lián)用后，增強了對人肝癌PLC/PRF/5細胞增殖的抑制作用。

阿霉素抑制癌細胞的主要作用機制是誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，前期研究表明，姜黃素對HepG2細胞的凋亡有促進作用[16]，但對于人肝癌PLC/PRF/5細胞的作用鮮有報道。本研究將姜黃素和阿霉素聯(lián)合作用于人肝癌PLC/PRF/5細胞，檢測其對人肝癌PLC/PRF/5細胞凋亡的影響，并與單獨使用阿霉素的凋亡反應(yīng)相比較，結(jié)果顯示，在顯微鏡鏡頭下相同的視野范圍內(nèi)，阿霉素組凋亡腫瘤細胞的數(shù)量顯著多于對照組，證明阿霉素能促進人肝癌PLC/PRF/5細胞的凋亡，而聯(lián)合組凋亡的腫瘤細胞數(shù)量多于阿霉素組，說明兩藥聯(lián)用之后促凋亡作用增強，表明姜黃素增加了阿霉素對人肝癌PLC/PRF/5細胞的凋亡作用。

Caspase家族是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中重要的凋亡蛋白酶，而Caspase-3處于各凋亡途徑的樞紐環(huán)節(jié)，是最重要的凋亡調(diào)控因子[17]，因此，Caspase-3的表達能側(cè)面反映細胞的凋亡程度。本研究的體外實驗中檢測了不同藥物干預(yù)后人肝癌PLC/PRF/5細胞Caspase-3的基因表達，結(jié)果顯示，聯(lián)合組的Caspase-3基因表達最強烈，顯著高于阿霉素組和對照組，阿霉素組Caspase-3基因表達顯著高于對照組。因此，進一步證實了姜黃素與阿霉素聯(lián)用對人肝癌PLC/PRF/5細胞凋亡的促進作用要強于阿霉素。

肝癌之所以預(yù)后性差，主要原因是肝癌細胞對化療藥物存在高度的耐受性[3-4]，因此，提高肝癌細胞對化療藥物的敏感性是治療肝癌的重要切入點。本研究中，我們通過比較不同藥物治療后小鼠體內(nèi)腫瘤體積的變化，評估肝癌細胞對不同化療藥敏感性的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三組治療后腫瘤體積以及治療前后體積差之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，治療后三組腫瘤的重量差異也有統(tǒng)計學(xué)意義，且姜黃素與阿霉素聯(lián)合組腫瘤的體積和重量均小于對照組和阿霉素組，表明阿霉素能有效抑制腫瘤的增長，其與姜黃素聯(lián)合使用后，抑制作用更顯著，證明姜黃素聯(lián)合阿霉素后，能使肝癌腫瘤對化療藥敏感性增加，具有化療藥增敏作用，且這種增敏作用可能是通過抑制腫瘤細胞的增殖、促進腫瘤細胞的凋亡而實現(xiàn)的。

綜上所述，姜黃素與阿霉素聯(lián)合使用后，較單獨使用阿霉素更能增加人肝癌PLC/PRF/5細胞的藥物敏感性，這種作用可能與抑制人肝癌PLC/PRF/5細胞的增殖，促進人肝癌PLC/PRF/5細胞的凋亡有關(guān)。