馬 林，羅家權(quán)，李 丹，張 康，張玉敏，裴秀叢，段志文，馬明月

0 引言

雙酚A(Bisphenol A，BPA)是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，其作為增塑劑廣泛應(yīng)用于水瓶、塑料袋、食品包裝袋等生活用品中。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年BPA的產(chǎn)量在390萬噸左右[1]。研究顯示，BPA存在于水體、土壤、空氣及生物體內(nèi)[2]。由于BPA的化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素類似，也被稱為類雌激素樣物質(zhì)，因此，BPA對(duì)動(dòng)物胚胎發(fā)育、生殖系統(tǒng)的損傷作用被廣泛關(guān)注。

實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞狀態(tài)分析系統(tǒng)(Real-time cell analysis,RTCA)是一種通過專用接種板下微金電子傳感器芯片，當(dāng)貼壁生長(zhǎng)在微電極表面的細(xì)胞引起電極界面阻抗的改變時(shí)，該阻抗值的變化直接反映細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)。因此，RTCA在細(xì)胞生理狀態(tài)下可以實(shí)時(shí)、連續(xù)、定量跟蹤細(xì)胞形態(tài)和增殖分化改變，為細(xì)胞水平的分析研究提供了一個(gè)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)信息獲取的獨(dú)特方法[3-4]。本文結(jié)合RTCA iCELLigence系統(tǒng)與臺(tái)盼藍(lán)染色法對(duì)BPA引起的小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞(TM3)的細(xì)胞毒性進(jìn)行監(jiān)測(cè)，通過對(duì)比研究細(xì)胞毒性的最佳實(shí)驗(yàn)手段。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞(TM3)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)、超凈工作臺(tái)(中國(guó)東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)、倒置顯微鏡(中國(guó)北京新惠澤奧科技有限公司)、臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)、RTCA iCELLigence(中國(guó)艾森生物有限公司)、Vi-cell細(xì)胞活力計(jì)數(shù)儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾克有限公司)。BPA(純度：99%，美國(guó)Sigma公司)；DMEM-F12培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清(美國(guó)Biochrom)；青霉素-鏈霉素(美國(guó)Biological Iudustries公司)；二甲基亞砜(DMSO,美國(guó)Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠TM3細(xì)胞培養(yǎng) TM3細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿T25瓶底80%左右進(jìn)行傳代，傳至第3代后開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 臺(tái)盼藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞毒性 當(dāng)細(xì)胞死亡時(shí)，由于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生破損，可透過臺(tái)盼藍(lán)染料。死亡或失去活力的細(xì)胞因?yàn)橹?，其色調(diào)比正常細(xì)胞暗淡。Vi-cell細(xì)胞活力分析儀通過對(duì)該色調(diào)明暗進(jìn)行拍照對(duì)比進(jìn)行活力的檢測(cè)，以此判斷受試物的細(xì)胞毒性。應(yīng)用Vi-cell對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，將8×104/ml的細(xì)胞接種于16孔板中，每孔加液量1 ml，接種24 h后吸去培養(yǎng)基，更換無血清培養(yǎng)基進(jìn)行同步化處理12 h，加入含不同濃度BPA(0、1、10、100、1 000 μmol/L)的含10%胎牛血清的培養(yǎng)液孵育24 h，進(jìn)行消化，取1 ml細(xì)胞懸液上樣至Vi-cell細(xì)胞活力分析儀中，按照儀器操作說明測(cè)定細(xì)胞活力，并計(jì)算相應(yīng)的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.3 RTCA接種密度測(cè)試 應(yīng)用Vi-cell進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，分別將0.5×105、1×105、2×105/ml的細(xì)胞200 μl接種于專用的E-plate 8孔板上進(jìn)行接種數(shù)量的預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 RTCA法測(cè)定細(xì)胞毒性 預(yù)實(shí)驗(yàn)后的細(xì)胞接種于8孔板，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)基，換做無血清培養(yǎng)基進(jìn)行同步化處理12 h，加入含不同濃度BPA(0、1、10、100、1 000 μmol/L)的含10%胎牛血清的培養(yǎng)液孵育24 h。通過RTCA系統(tǒng)各孔微電阻量的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)TM3細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，通過細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)力變化反應(yīng)曲線，觀察BPA對(duì)TM3細(xì)胞毒性情況，并計(jì)算出相應(yīng)的IC50。

2 結(jié)果

2.1 TM3細(xì)胞接種密度檢測(cè) 將3種不同密度的細(xì)胞接種于E-plate 8孔板后培養(yǎng)96 h，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線表明，當(dāng)接種密度為2×105/ml時(shí)，細(xì)胞在接種24 h后進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用2×105/ml的接種密度。見圖1。

圖1 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞不同接種密度生長(zhǎng)曲線

2.2 臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)法檢測(cè)BPA對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性 應(yīng)用Vi-cell細(xì)胞活力分析儀檢測(cè)各濃度BPA暴露24 h后活性細(xì)胞比例。與未加入BPA的DMSO對(duì)照組比較，各組活細(xì)胞比例出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，并且在1 000 μmol/L時(shí)下降最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)法分析BPA對(duì)TM3的細(xì)胞毒性情況

2.3 臺(tái)盼藍(lán)染色法分析BPA對(duì)TM3的細(xì)胞毒性 各BPA暴露組的細(xì)胞活力IC50為745 μmol/L，根據(jù)濃度的反對(duì)數(shù)所得的濃度曲線如圖3所示。

2.4 RTCA分析系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果 采用RTCA分析系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，共監(jiān)測(cè)70 h，結(jié)果顯示，無血清同步化處理前細(xì)胞呈指數(shù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，同步化處理后細(xì)胞增長(zhǎng)的速度變慢，提示達(dá)到同步化處理的目的。加入BPA后，不同濃度的BPA均能使TM3的細(xì)胞活力出現(xiàn)不同程度的下降，其中濃度為1 000 μmol/L時(shí)下降最為明顯。見圖4。

2.5 RTCA活力檢測(cè)法 RTCA活力檢測(cè)法結(jié)果表明，BPA對(duì)TM3細(xì)胞毒性的IC50為704 μmol/L，其濃度曲線及結(jié)果如圖5所示。

圖3 反對(duì)數(shù)變換后的細(xì)胞活力隨濃度變化曲線

圖4 RTCA監(jiān)測(cè)BPA對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用

圖5 RTCA分析系統(tǒng)計(jì)算IC50的細(xì)胞指數(shù)情況

3 討論

RTCA系統(tǒng)通過專用培養(yǎng)板上的新型傳感芯片設(shè)計(jì)，可連續(xù)監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)的全過程，并且其監(jiān)測(cè)是無標(biāo)記、無創(chuàng)傷型的數(shù)據(jù)獲取和分析平臺(tái)[5]，其專用的E-Plate板底部鋪滿微金電極，細(xì)胞數(shù)量及大小的變化影響電阻抗的變化，其變化反應(yīng)為電阻值的改變，以細(xì)胞指數(shù)(CI)的形式輸出，能夠定量評(píng)估細(xì)胞數(shù)量、存活率及形態(tài)變化等細(xì)胞生理狀態(tài)指標(biāo)?；谧杩箘?dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)胞活力與相應(yīng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)與MTT法得到的結(jié)果一致[6]。本實(shí)驗(yàn)通過RTCA法與傳統(tǒng)的臺(tái)盼藍(lán)染色法分析BPA對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性過程中，在比較兩種方法的同時(shí)，也對(duì)BPA所導(dǎo)致的細(xì)胞毒性情況進(jìn)行雙重驗(yàn)證。

環(huán)境雌激素BPA在環(huán)境中廣泛存在，具有劑量小、潛伏期長(zhǎng)和接觸頻繁等特點(diǎn)，是危害較大的一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[7]。BPA可通過皮膚、呼吸道、消化道等多種途徑進(jìn)入機(jī)體，引起多系統(tǒng)的損傷，如神經(jīng)系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)，并通過基因的改變遺傳給下一代，其對(duì)生殖系統(tǒng)的損害已越來越受到人們的重視[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的BPA均使TM3細(xì)胞活力出現(xiàn)不同程度的降低，其中以1 000 μmol/L下降最為明顯。兩種方法計(jì)算出的IC50均為700 μmol/L左右，其絕對(duì)值并不完全相同的原因可能是不同的細(xì)胞批次及檢測(cè)設(shè)備靈敏性的差異，但其范圍與趨勢(shì)均相同。從整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程來看，RTCA能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞不同時(shí)間的生長(zhǎng)狀態(tài)，從細(xì)胞指數(shù)曲線上可以直觀看到整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程TM3的生長(zhǎng)情況，在對(duì)處理時(shí)間的節(jié)點(diǎn)選擇上，可以根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況進(jìn)行判斷，依據(jù)更加充分可靠。因此，RTCA系統(tǒng)較好地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)臺(tái)盼藍(lán)染色法只能看到終點(diǎn)情況的缺點(diǎn)，其結(jié)果與周慧等[11]研究的結(jié)果相同。通過對(duì)兩種方法的比較，我們可以看出，RTCA系統(tǒng)具有更加準(zhǔn)確、直觀等特點(diǎn)，是一種細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域的良好實(shí)驗(yàn)手段。