劉 博，戚 誠*，趙 爽，趙曉東，劉學(xué)臣，張立超，石 暢

0 引言

食管癌發(fā)病率在全球呈現(xiàn)上升趨勢，在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中，其死亡率較高。食管癌以發(fā)現(xiàn)晚為特點，5年生存率極低，大部分食管癌發(fā)現(xiàn)時均無手術(shù)機(jī)會[1]。目前，放化療是藥物治療不能手術(shù)的食管癌的主要治療方式[2]，中藥在惡性腫瘤中的應(yīng)用已經(jīng)取得了極大進(jìn)展，尤其中藥聯(lián)合化療藥物的應(yīng)用，可以達(dá)到提高治療有效率、減少化療藥物劑量及毒副反應(yīng)、延長患者生存期的目的[3-5]。華蟾素是近年應(yīng)用的抗腫瘤藥物之一，在肺癌及胃癌等惡性腫瘤中有應(yīng)用[6]，獲得了肯定的效果，但目前其在食管癌中的作用及機(jī)制研究缺乏客觀實驗證據(jù)。本研究采用華蟾素聯(lián)合氟尿嘧啶，觀察食管癌離體細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的變化，評價華蟾素對食管癌細(xì)胞的殺滅作用及對氟尿嘧啶化療增效作用，并探討其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供客觀實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌細(xì)胞株TE-1購自上海中科院細(xì)胞庫，采用含10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素的1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行貼壁細(xì)胞培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，取對數(shù)生長期的TE-1細(xì)胞進(jìn)行實驗，所有的實驗均重復(fù)3次，以平均值進(jìn)行統(tǒng)計。華蟾素注射液(CAS No.521-61-9)購自安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司，氟尿嘧啶注射液(CAS No. 51-21-8)購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司。ECL發(fā)光試劑盒、DAB顯色試劑盒及BCA定量試劑盒均購自南京凱基生物公司。MTT試劑盒購自美國Biosharp公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國Millpore公司；Bcl-2單克隆抗體、Bax單克隆抗體、Cleaved PARP多克隆抗體及Survivin多克隆抗體均購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司。實驗細(xì)胞分為陰性對照組(Negative Control組)、華蟾素干預(yù)組(Cinobufotalin組)、華蟾素及氟尿嘧啶共同干預(yù)組(Cinobufotalin+5-FU組)及氟尿嘧啶組(5-FU組)，Negative Control組給予DMSO干預(yù)作為空白對照，Cinobufotalin+5-FU組及5-FU組氟尿嘧啶濃度均為25 μmol/L。

1.2 方法

1.2.1 Western印跡 Cinobufotalin組以0、5、50、500 μmol/L濃度梯度華蟾素作用48 h后，依照細(xì)胞蛋白提取試劑盒規(guī)定步驟進(jìn)行蛋白提取，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白進(jìn)行分離并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。加入5%脫脂奶粉，在室溫條件下進(jìn)行90 min封閉后，分別加入Bcl-2、Bax、Cleaved PARP及Survivin一抗，進(jìn)行孵育過夜后加入對應(yīng)二抗，再孵育后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法顯色。應(yīng)用Quantity One對灰度值進(jìn)行定量分析。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測TE-1凋亡及細(xì)胞周期 Cinobufotalin組、Cinobufotalin+5-FU組(50 μmol/L華蟾素干預(yù)24 h)、Negative Control組及5-FU組TE-1細(xì)胞培養(yǎng)48 h后轉(zhuǎn)移至EP管，給予預(yù)冷及PBS洗滌后加入預(yù)冷70%乙醇，在4 ℃溫度下固定24 h。1 000 r/min 離心10 min后棄上清。對每個樣品均采用PBS重懸，加0.5% PI 40 μl、RNase A 20 μl(10 mg/ml)，4 ℃下避光溫浴35 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。另取培養(yǎng)48 h的各組細(xì)胞，依據(jù)Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書規(guī)定步驟測定細(xì)胞凋亡，軟件Cell Quest進(jìn)行凋亡率分析，計算早期凋亡陽性的細(xì)胞百分比。

1.2.3 MTT法檢測不同華蟾素濃度梯度及不同培養(yǎng)時間TE-1細(xì)胞存活率 各組細(xì)胞以6×104/ml數(shù)加入96孔板內(nèi)培養(yǎng)6 h，細(xì)胞貼壁后Cinobufotalin組及Cinobufotalin+5-FU組加入0、5、10、15、20、25 μmol/L濃度梯度的華蟾素作用48 h，每個濃度均設(shè)3個復(fù)孔。48 h后在每孔內(nèi)均加入5 mg/L的10% MTT液，在37 ℃溫箱孵育4 h后棄上清，加入150 μl DMSO，震蕩25 min后進(jìn)行光密度值(OD值)測定，計算細(xì)胞存活率。另取細(xì)胞待貼壁后Cinobufotalin組及Cinobufotalin+5-FU組細(xì)胞加入50 μmol/L的華蟾素，分別在細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h后行MTT檢測，步驟同前，測定TE-1細(xì)胞在不同時點存活率。

2 結(jié)果

2.1 華蟾素干預(yù)后凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blot檢測0、5、50、500 μmol/L濃度梯度華蟾素干擾前后凋亡相關(guān)蛋白變化。隨著Cinobufotalin濃度升高，Bcl-2、Survivin蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性下降，與0 μmol/L濃度對比，Bcl-2蛋白表達(dá)在5、50、500 μmol/L差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.922，P<0.01；t=7.736，P<0.01；t=11.075，P<0.01)，Survivin蛋白表達(dá)在50、500 μmol/L差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.248，P<0.01；t=12.663，P<0.01)；隨著Cinobufotalin濃度升高，Cleaved PARP、Bax蛋白表達(dá)呈劑量依賴性上升，與0 μmol/L 濃度對比，Cleaved PARP在5、50、500 μmol/L 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.179，P<0.05；t=8.631，P<0.01；t=9.254，P<0.01)，Bax蛋白在50、500 μmol/L差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.169，P<0.05；t=7.428，P<0.01)，見圖1。

圖1 華蟾素干預(yù)后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.2 華蟾素干預(yù)后TE-1細(xì)胞凋亡變化 流式細(xì)胞儀檢測顯示，Negative Control組、Cinobufotalin組、Cinobufotalin+5-FU組、5-FU組的TE-1細(xì)胞凋亡率分別為21.32%、39.63%、59.52%、45.21%，Cinobufotalin組的TE-1細(xì)胞凋亡率高于Negative組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.236，P<0.05)；Cinobufotalin+5-FU組的TE-1細(xì)胞凋亡率高于Negative Control組、Cinobufotalin組、5-FU組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.809，P<0.01；t=4.132，P<0.05；t=3.671，P<0.05)。

2.3 華蟾素干預(yù)后TE-1細(xì)胞周期變化 與Negative Control組對比，Cinobufotalin組TE-1細(xì)胞培養(yǎng)48 h后細(xì)胞周期停留在G1期及G2期的比例減少，在S期的比例升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.504，P<0.05；t=2.842，P<0.05；t=3.493，P<0.05)；與Negative Control組對比，Cinobufotalin+5-FU組TE-1細(xì)胞培養(yǎng)48 h后細(xì)胞周期停留在G1期及G2期的比例減少，S期的比例升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.024，P<0.01；t=8.373，P<0.01；t=7.376，P<0.01)；與Cinobufotalin組對比，Cinobufotalin+5-FU組TE-1細(xì)胞培養(yǎng)48 h后細(xì)胞周期停留在G1期及G2期的比例減少，S期的比例升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.436，P<0.05；t=3.226，P<0.05；t=3.503，P<0.05)；與5-FU組對比，Cinobufotalin+5-FU組TE-1細(xì)胞培養(yǎng)48 h后細(xì)胞周期停留在G1期及G2期的比例減少，S期的比例升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.163，P<0.05；t=2.965，P<0.05；t=3.672，P<0.05)，見表1。

表1 流式細(xì)胞檢測細(xì)胞周期(%)

2.4 華蟾素干預(yù)后不同培養(yǎng)時間TE-1細(xì)胞存活率 MTT顯示，給予 Cinobufotalin 50 μmol/L干預(yù)條件下TE-1細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h后，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)時間依賴性下降趨勢，與Negative Control組對比，Cinobufotalin組TE-1細(xì)胞培養(yǎng)48、72、96 h后存活率低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.029，P<0.05；t=3.176，P<0.05；t=3.992，P<0.05)；與Negative Control組對比，Cinobufotalin+5-FU組TE-1細(xì)胞培養(yǎng)48、72、96 h后存活率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.527，P<0.01；t=12.459，P<0.01；t=13.579，P<0.01)；與Cinobufotalin組對比，Cinobufotalin+5-FU組TE-1細(xì)胞培養(yǎng)48、72、96 h后存活率低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.236，P<0.01；t=7.932，P<0.01；t=9.19，P<0.01)；與5-FU組對比，Cinobufotalin+5-FU組TE-1細(xì)胞培養(yǎng)48、72、96 h后存活率低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.164，P<0.01；t=6.984，P<0.01；t=9.052，P<0.01)，見圖2。

圖2 MTT檢測不同培養(yǎng)時間華蟾素處理后細(xì)胞

2.5 不同濃度華蟾素干預(yù)后TE-1細(xì)胞存活率 不同濃度梯度(0、5、10、15、20、25 μmol/L)的華蟾素作用48 h后，Cinobufotalin組及Cinobufotalin+5-FU組TE-1細(xì)胞存活率呈現(xiàn)劑量依賴性下降，與0 μmol/L濃度對比，Cinobufotalin組在20 μmol/L及25 μmol/L差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.217，P<0.05；t=3.021，P<0.05)，Cinobufotalin+5-FU組在15、20、25 μmol/L差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.187，P<0.05；t=5.853，P<0.01；t=7.293，P<0.01)；與Cinobufotalin組相比，Cinobufotalin+5-FU組TE-1細(xì)胞存活率在20、25 μmol/L較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.473，P<0.05；t=3.578，P<0.05)，見圖3。

圖3 MTT檢測不同濃度華蟾素處理后細(xì)胞存活率(培養(yǎng)48 h)

3 討論

大部分食管癌患者在確診時已經(jīng)失去手術(shù)時機(jī)，以手術(shù)為基礎(chǔ)的綜合治療在2/3的患者中不能實現(xiàn)[7]，放療及化療是目前新輔助治療或綜合治療的主要內(nèi)容，尤其對于晚期食管癌，放療及化療是減輕患者癥狀、延長患者生存期的主要治療方式[8]?；熕幉涣挤磻?yīng)大，一部分食管癌患者對化療敏感性差，且易發(fā)生耐藥。中藥治療在食管癌方面是研究的主要方向，并取得了一定進(jìn)展[9]。華蟾素提取自干蟾皮，是其中的脂溶性成分。多項研究表明，在中藥中，華蟾素具有較強(qiáng)的抗癌療效，用于肺癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌及肝癌等惡性腫瘤的治療，但目前對其抗癌機(jī)制的研究較少[10-12]。

本研究顯示，華蟾素干擾后，Bcl-2/Bax通路中，Bcl-2及Survivin蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性下降，二者表達(dá)受到抑制，Cleaved PARP及Bax蛋白表達(dá)呈劑量依賴性上升，二者表達(dá)受到激活，表明華蟾素可能通過Bcl-2/Bax信號通路發(fā)揮對惡性腫瘤細(xì)胞的作用。Bcl-2/Bax信號通路是食管癌細(xì)胞活性過程中凋亡相關(guān)通路，Bcl-2/Bax比例對食管癌細(xì)胞凋亡具有重要影響，也是食管癌預(yù)后的標(biāo)志物之一[13]，二者比例降低會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞增殖活性降低。Survivin及Cleaved PARP是該信號通路的下游蛋白，直接影響腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡等惡性行為，Survivin是重要的促癌基因，PARP裂解為Cleaved PARP會抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)其凋亡，是重要的抑癌基因[14]。進(jìn)一步細(xì)胞實驗顯示，華蟾素干擾后TE-1細(xì)胞凋亡率升高，而華蟾素聯(lián)合氟尿嘧啶TE-1細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增高，明顯高于華蟾素或氟尿嘧啶單藥應(yīng)用，細(xì)胞周期研究也顯示，華蟾素及氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用后TE-1細(xì)胞留在G1期及G2期的比例減少，S期的比例升高，均強(qiáng)于二者單藥應(yīng)用。MTT顯示，給予華蟾素干預(yù)后，TE-1細(xì)胞存活率呈現(xiàn)時間依賴性下降趨勢，聯(lián)合氟尿嘧啶后，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)進(jìn)一步下降趨勢，均較單藥應(yīng)用下降明顯。隨著華蟾素濃度升高，聯(lián)合氟尿嘧啶后細(xì)胞存活率也呈現(xiàn)明顯下降趨勢，呈現(xiàn)濃度依賴性。病理標(biāo)本研究顯示，華蟾素處理后，癌細(xì)胞表現(xiàn)為核破碎，組織壞死及變性，對腫瘤細(xì)胞具有殺滅作用。氟尿嘧啶是消化系統(tǒng)腫瘤最常用的化療藥物，在食管癌中也是化療的首選藥物之一，但其抗腫瘤作用有限，不良反應(yīng)也較為常見，聯(lián)合中藥應(yīng)用可以達(dá)到化療增效、降低毒副作用的目的。本研究顯示，華蟾素聯(lián)合氟尿嘧啶應(yīng)用于食管癌細(xì)胞，在促進(jìn)細(xì)胞凋亡、降低細(xì)胞生存率、抑制細(xì)胞復(fù)制等方面均優(yōu)于單藥應(yīng)用。

另有研究顯示，華蟾素可提高腫瘤患者細(xì)胞免疫及體液免疫水平，提高患者自體腫瘤細(xì)胞殺滅能力。隨著更多靶點的發(fā)現(xiàn)，靶向治療也是食管癌治療的主要研究方向，中藥聯(lián)合靶向藥物治療可能達(dá)到增強(qiáng)治療效果、減輕藥物毒副反應(yīng)的目的。目前，化療聯(lián)合放療是術(shù)前新輔助治療、術(shù)后輔助治療及晚期食管癌治療的主要藥物治療方式，而中藥聯(lián)合化療在越來越多的腫瘤治療中心展開，并取得了重大進(jìn)展，華蟾素作為近年研發(fā)的抗腫瘤作用較強(qiáng)的中藥之一，受到很多研究者的關(guān)注。對華蟾素中抗腫瘤單劑的進(jìn)一步提取是未來的研究方向。