劉婷，趙華，魏楓，王揚(yáng)，任秀寶

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌（non small lung cancer，NSCLC）占肺癌的80%左右［1］。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響肺癌預(yù)后的重要因素。目前，肺癌仍缺乏早期診斷和判斷預(yù)后的有效指標(biāo)，尋找預(yù)后相關(guān)指標(biāo)對(duì)于延長(zhǎng)患者生存期、提高生活質(zhì)量有至關(guān)重要的意義。高遷移率族（high–mobility group，HMG）蛋 白 由HMGA、HMGB及HMGN三個(gè)家族組成。其中HMGB1是細(xì)胞內(nèi)一種含量豐富的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，由215個(gè)氨基酸組成，含有2個(gè)同源性DNA結(jié)合區(qū)（box A和box B）及一個(gè)酸性C末端區(qū)［2］；HMGB1自身與DNA有較高的非特異性親和力，參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修飾［3］。HMGB1在多種腫瘤組織中高表達(dá)，并參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［2,4-8,9］。HMGN1是一種高度保守的非組蛋白，人類HMGN1蛋白由100個(gè)氨基酸組成。在細(xì)胞核HMGN1可通過(guò)直接作用于核小體而調(diào)節(jié)基因表達(dá)和影響染色體結(jié)構(gòu)，從而參與多種重要的生物學(xué)過(guò)程［10-12］。

警報(bào)素是一群結(jié)構(gòu)多樣但進(jìn)化上并不相關(guān)的多功能內(nèi)源性分子，細(xì)胞損傷或壞死時(shí)其釋放到細(xì)胞外。一旦被釋放到細(xì)胞外，警報(bào)素即可作為內(nèi)源性的危險(xiǎn)信號(hào)活化天然免疫細(xì)胞［13］。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1和HMGN1作為一種警報(bào)素在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用［14-15］。目前，研究已經(jīng)證實(shí)HMGB1和HMGN1具有警報(bào)素功能，血清中的HMGN1與NSCLC的轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)［14］。但是尚少見HMGN1在NSCLC組織中的表達(dá)情況的報(bào)道。因此，本研究檢測(cè)了NSCLC組織中HMGB1和HMGN1的表達(dá)，以探討兩者與NSCLC預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2004年1月—2011年5月就診于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院的NSCLC患者病理組織石蠟標(biāo)本91例，并制成石蠟切片。男57例，女34例；＜60歲19例，≥60歲72例；腺癌24例，鱗癌67例；Ⅰ期32例，Ⅱ期26例，Ⅲ期19例，Ⅳ期14例?；颊呔邮苓^(guò)肺組織切除術(shù)或組織穿刺活檢術(shù)，經(jīng)病理確診為NSCLC，并根據(jù)國(guó)際TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行分期。患者均自診斷之日開始隨訪，隨訪時(shí)間2～151個(gè)月，中位隨訪時(shí)間50個(gè)月。本研究獲天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 兔源多克隆抗HMGN1抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，兔源多克隆抗HMGB1抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京中衫金橋生物有限公司；二抗即酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物購(gòu)于邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 免疫組化檢測(cè)HMGN1、HMGB1在肺癌組織中的表達(dá)情況 石蠟切片脫蠟后用枸櫞酸鹽高溫高壓修復(fù)3 min，自然晾至室溫，3%H2O2封閉30 min，PBS洗3遍，一抗4℃孵育過(guò)夜，一抗稀釋液比例為1∶300。PBS洗3遍后，于室溫孵育二抗30 min，加新配制的DAB顯色液（1 mL蒸餾水加入50 μL底物A，50 μL底物B，50 μL底物C并充分搖勻），顯色3～5 min，至出現(xiàn)棕色陽(yáng)性反應(yīng)。蘇木素染色2～3 min，梯度脫水，晾干后樹膠封片顯微鏡下觀察。隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野，≥80%腫瘤細(xì)胞胞漿著色為陽(yáng)性表達(dá)，＜80%為陰性表達(dá)。

1.4 觀察指標(biāo) 記算患者HMGN1、HMGB1的陽(yáng)性表達(dá)率并比較兩者表達(dá)水平的相關(guān)性，觀察兩者表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性以及與無(wú)進(jìn)展生存期（profession free survival，PFS）、總生存期（overall survival，OS）的關(guān)系。其中PFS定義為從手術(shù)日期到腫瘤復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移，或者是到最后1次隨訪的間隔時(shí)間。OS是指從手術(shù)日期到患者因腫瘤死亡或者到最后1次隨訪的間隔時(shí)間。非腫瘤原因死亡的病例未納入本研究。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。相關(guān)性分析用四格表χ2檢驗(yàn)并計(jì)算列聯(lián)系數(shù)（rs）。HMGB1、HMGN1在不同分期的表達(dá)水平比較用非參數(shù)檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，利用Log-rankχ2進(jìn)行生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGN1與HMGB1的相關(guān)性HMGB1和HMGN1細(xì)胞胞漿的陽(yáng)性表達(dá)率分別為40%（36/91）和31%（28/91），其免疫組化結(jié)果見圖1。HMGN1和HMGB1的表達(dá)水平呈正相關(guān)（rs=0.319，P=0.001），見表1。

Fig.1 The expression levels of HMGB1 and HMGN1（IHC，×400）圖1 HMGB1和HMGN1在細(xì)胞漿的表達(dá)水平（IHC，×400）

2.2 HMGB1和HMGN1在各個(gè)分期的陽(yáng)性表達(dá)率比較 細(xì)胞漿HMGN1的表達(dá)水平與肺癌的分期有關(guān)，晚期肺癌（Ⅲ～Ⅳ期）患者的陽(yáng)性表達(dá)比例顯著高于早期肺癌（Ⅰ～Ⅱ期）患者（P＜0.05），而HMGB1的陽(yáng)性表達(dá)比例在各個(gè)分期組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

Tab.1 The correlation analysis of HMGB1 and HMGN1表1 HMGB1和HMGN1表達(dá)水平的相關(guān)性分析

Tab.2 The positive expression levels of HMGN1 and HMGB1 in different stages of lung cancer表2 胞漿HMGN1和HMGB1在肺癌不同分期的陽(yáng)性表達(dá)率 ［例（%）］

2.3 HMGB1和HMGN1表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性HMGB1的表達(dá)水平與吸煙有關(guān)，吸煙者陽(yáng)性率更高（P＜0.05），而與年齡、性別、病理類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)；HMGN1的陽(yáng)性表達(dá)率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中更高（P＜0.05），而與年齡、性別、有無(wú)吸煙、病理類型和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，見表3。

Tab.3 Correlation between cytoplasmic expressions of HMGN1 and HMGB1 and clinical parameters of NSCLC patients表3 NSCLC患者HMGN1、HMGB1胞漿陽(yáng)性表達(dá)率與臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性 ［例（%）］

2.4 HMGB1和HMGN1與預(yù)后的相關(guān)性 單因素分析顯示，在不同性別、年齡是否大于60歲、有無(wú)吸煙史、HMGN1和HMGB1表達(dá)情況間中位PFS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而病理類型為腺癌、早期肺癌（Ⅰ～Ⅱ期）、無(wú)遠(yuǎn)處和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中位PFS較長(zhǎng)，生存質(zhì)量較好（P＜0.05）；在年齡是否大于60歲、有無(wú)吸煙史、病理類型、HMGN1和HMGB1表達(dá)情況間中位OS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而男性、早期肺癌、無(wú)遠(yuǎn)處和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的中位OS較長(zhǎng)，生存質(zhì)量較好（P＜0.05），見表4。HMGB1陰性表達(dá)組和陽(yáng)性表達(dá)組的5年累積PFS率分別為57.9%和49%，5年累積OS率為55.9%和36.1%，HMGN1陰性表達(dá)組和陽(yáng)性表達(dá)組的5年累積PFS為59.2%和43.3%、5年累積OS為55.0%和32.1%，見圖2。

Tab.4 Univariate analysis of influencing factors for prognosis of NSCLC表4 影響NSCLC預(yù)后的單因素分析

3 討論

高遷移率族蛋白是一組非組蛋白核小體結(jié)合蛋白，它們通過(guò)與染色體結(jié)合調(diào)節(jié)DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制及損傷修復(fù)［16］。其中HMGB1和HMGN1被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，并且可以預(yù)測(cè)NSCLC的預(yù)后。HMGB1最初被認(rèn)為主要是作為一種重要的晚期炎癥介質(zhì)介導(dǎo)膿毒癥的病理過(guò)程，此作用依賴于干擾素β（IFN-β）介導(dǎo)的JAK/STAT信號(hào)通路；后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1還參與自身免疫性疾病、缺血再灌注損傷等多種非感染性炎癥疾病的病理過(guò)程［17］。有研究表明，HMGB1在多種腫瘤組織中高表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［3，18］。

Fig.2 Correlation of HMGN1 and HMGB1 expression levels and prognosis圖2 HMGN1、HMGB1胞漿表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系

在高遷移率蛋白家族中，HMGN1和HMGB1具有警報(bào)素的作用，可募集和活化樹突狀細(xì)胞（DC）等免疫細(xì)胞發(fā)揮增強(qiáng)免疫的作用。HMGB1對(duì)腫瘤的作用具有雙向性，一方面，HMGB1調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，影響腫瘤組織局部微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤血管新生，為腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移提供有利條件。另一方面，腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌HMGB1，其與Toll樣受體2（toll like receptor2，TLR2），或者TLR4相互作用激發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)。HMGN1的作用與其所在的位置有關(guān)，細(xì)胞核的HMGN1能夠調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄并通過(guò)直接結(jié)合核小體影響染色體結(jié)構(gòu)［19-20］；而分泌到細(xì)胞外的HMGN1可通過(guò)與DC的相互作用啟動(dòng)TLR/MyD88信號(hào)通路，增強(qiáng)DC抗原提呈能力，激活T細(xì)胞，提高抗腫瘤免疫反應(yīng)［13,21］。同時(shí)筆者團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)，HMGN1和HMGB1的表達(dá)水平與CD3+和CD8+細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)，這可能提示HMGN1和HMGB1也可能募集T淋巴細(xì)胞而發(fā)揮抗腫瘤作用［22-23］。

HMGB1的釋放主要是由于蛋白的核質(zhì)轉(zhuǎn)位或細(xì)胞膜被破壞，而目前尚缺乏HMGN1分泌機(jī)制相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，由于腫瘤組織內(nèi)分泌的HMGB1和HMGN1無(wú)法檢測(cè)，因此可以將胞質(zhì)中的表達(dá)認(rèn)為是細(xì)胞存在向胞外分泌情況。本研究檢測(cè)了胞漿中HMGB1和HMGN1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HMGN1與HMGB1的胞漿表達(dá)水平呈一定相關(guān)性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)晚期肺癌患者的HMGN1陽(yáng)性表達(dá)率比早期肺癌組織顯著升高，但是Ⅳ期肺癌患者中HMGN1的水平與Ⅲ期相比卻降低。這一結(jié)果與Wei等［14］的結(jié)果一致，表明HMGN1與腫瘤分期有關(guān)，但是Ⅳ期中HMGN1水平降低，推測(cè)原因可能是由于在腫瘤的不同發(fā)展階段HMGN1發(fā)揮的作用不同，早期HMGN1主要在細(xì)胞核中存在，隨著腫瘤的進(jìn)展，刺激HMGN1開始從細(xì)胞核遷移至細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而分泌到外周開始發(fā)揮抗腫瘤的免疫作用，因此細(xì)胞質(zhì)中HMGN1的表達(dá)水平隨著分期而升高。而在發(fā)生轉(zhuǎn)移的Ⅳ期肺癌患者中，HMGN1遷移水平降低，可能是因?yàn)槟[瘤轉(zhuǎn)移導(dǎo)致發(fā)生免疫逃逸，而限制了HMGN1的警報(bào)素作用。

本研究發(fā)現(xiàn)HMGN1的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示高HMGN1表達(dá)水平發(fā)生更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，同時(shí)腺癌的中位PFS較長(zhǎng)，這可能與腺癌目前對(duì)于靶向藥物的敏感性高有關(guān)。另外本研究中男性的中位OS長(zhǎng)于女性，這與既往的認(rèn)知有一定的矛盾，一般男性吸煙人群較多，因此相比女性患肺癌率高，預(yù)后較差，這一結(jié)論仍舊需要納入更大樣本的驗(yàn)證。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)胞漿中HMGN1和HMGB1表達(dá)水平越高，越可能發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這也與以上的推測(cè)一致，表明HMGN1和HMGB1可能預(yù)示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)HMGN1與OS有一定的相關(guān)性，HMGN1表達(dá)越高，預(yù)后越差，雖然這一結(jié)論沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但也預(yù)示HMGN1可能成為預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)，今后需要擴(kuò)大納入病例數(shù)對(duì)預(yù)后進(jìn)行深入研究。

綜上所述，HMGN1和HMGB1在腫瘤發(fā)展中的作用具有雙相性，在不同的發(fā)展階段和位于不同的位置，其產(chǎn)生的作用不同。因此，需要準(zhǔn)確地把握HMGN1和HMGB1的作用時(shí)機(jī)，最大限度地發(fā)揮兩者的警報(bào)素作用，進(jìn)而募集免疫細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。今后需要更加深入的基礎(chǔ)研究和臨床研究來(lái)進(jìn)一步探討高遷移率蛋白的作用，為NSCLC的治療提供新的思路。