劉師偉，李輝，張奇雪，蔣昭，趙秀娟，吳云丹

胃癌作為世界上第五大常見癌癥，其在惡性腫瘤導(dǎo)致的死亡中占第三位［1］。盡管聯(lián)合手術(shù)、放療和化療多種治療手段，目前胃癌患者的預(yù)后仍然很差，5年的總體生存率小于25%［2］。目前對于各種腫瘤包括胃癌的精準(zhǔn)治療十分熱門，理解其發(fā)生發(fā)展的分子機制并依此尋找安全高效的基因治療方法變得日趨緊迫。

雙特異性磷酸酶（DUSP）屬于酪氨酸特異性磷酸酶家族的經(jīng)典成員，其功能除涉及生物體內(nèi)多種基本的生理活動，如增殖調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3］。目前已發(fā)現(xiàn)經(jīng)典及非經(jīng)典的DUSP成員達30余種，其中DUSP2（又稱PAC-1）已被證實不僅是免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)者［4］，而且在多種腫瘤，如前列腺癌、肺癌、膠質(zhì)瘤及白血病等中呈低表達，并且通過多種信號通路參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展［5］。有文獻報道，DUSP2在體外可負向調(diào)控細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）和P38的活性［6］，但DUSP2在胃癌中的作用及機制目前尚未明確。為此，本實驗構(gòu)建了DUSP2過表達的慢病毒載體，并進一步篩選鑒定DUSP2穩(wěn)定過表達的MKN-45胃癌細胞株，進而探討上調(diào)的DUSP2對胃癌細胞增殖和凋亡的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人源腎上皮細胞系293T細胞、胃癌細胞系（MKN-45、SGC-7901、HGC-27、N-87）及正常的胃上皮細胞系GES-1（江陰康眾康民生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；Trans-5a感受態(tài)細胞（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；pLVX-EF1a-IRES-puro載體、psPAX2、pMD2.G包裝質(zhì)粒（上海滬震生物有限公司）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、雙抗（美國Hyclone公司）；嘌呤霉素（Puromycin）（美國Sigma公司）；RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒、Fast DigestXbalⅠ、NotⅠ內(nèi)切酶（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Fast SYBR Green Master Mix（德國Roche公司）；無內(nèi)毒素高純質(zhì)粒中量提取試劑盒（離心柱型）（美國Biomiga公司）；RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；FLAG、ERK、p-ERK（Thr202/Tyr204）、P38、p-P38蛋白抗體（美國CST公司）；羊抗兔、兔抗鼠二抗、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Millipore公司）。CO2培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher Scientific公司；電泳槽、電泳儀購自Bio-Rad公司。引物合成及測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 胃癌患者預(yù)后價值評估 首先，通過公共的在線分析工具KM plotter（http://kmplot.com）評估DUSP2的表達對胃癌患者的預(yù)后價值。該分析工具整合了6個提交在GEO數(shù)據(jù)庫中的胃癌患者基因芯片結(jié)果，排除缺失數(shù)據(jù)后將876例樣本納入統(tǒng)計范圍，依據(jù)DUSP2mRNA表達水平繪制Kaplan-Meier生存曲線，比較DUSP2表達高低患者生存率的差異。。

1.2.2 實時定量PCR檢測DUSP2mRNA表達量 胃癌細胞株MKN-45、SGC-7901、HGC-27、N-87及正常的胃上皮細胞系GES-1均為貼壁生長，采用RPMI-1640完全培養(yǎng)基（10%FBS+1%雙抗）置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱飽和濕度下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的5種細胞，采用Trizol法抽提總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：42℃60 min；95℃5 min；4℃5 min。以上述5種細胞的cDNA為模板，通過實時定量PCR分別檢測管家基因β-actin（內(nèi)參）和DUSP2mRNA的表達水平。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，40個循環(huán)。引物序列：DUSP2引物上游5′-TGCCCCAACCACTTTGAGG-3′；下游5′-AGTCAATGAAGC CTATGGCCT-3′；β-actin引物上游5′-ATTGCCGACAGGAT GCAGA-3′；下游5′-GAGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3′。最后采用2-ΔΔCt相對定量法進行分析。

1.2.3 重組真核慢病毒表達質(zhì)粒pLVX-DUSP2-FLAG的構(gòu)建 （1）DUSP2-FLAG融合片段的擴增：以pCDNA3.1-DUSP2-FLAG質(zhì)粒為模板，PCR擴增DUSP2-FLAG融合基因片段。（2）pLVX載體線性化：使用快速限制性內(nèi)切酶XbalⅠ、NotⅠ線性化pLVX-EF1a-IRES-puro質(zhì)粒載體，同時切膠回收雙酶切PCR產(chǎn)物。（3）DUSP2-FLAG PCR產(chǎn)物與pLVXEF1a-IRES-puro線性載體連接：pLVX-EF1a-IRES-puro載體和PCR產(chǎn)物連接比例為1∶3，16℃反應(yīng)過夜。（4）重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化Trans-5a感受態(tài)細胞，挑取單克隆搖菌，使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，將提取的pLVX-DUSP2-FLAG質(zhì)粒用Fast DigestXbalⅠ、NotⅠ雙酶切，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進行初步鑒定，然后進行測序驗證。

1.2.4 DUSP2過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建 用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000包裹慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)（pLVX-DUSP2-FLAG/pLVX control、pMD2.G、psPAX2）共轉(zhuǎn)染293T細胞進行病毒包裝；48～72 h后大量病毒產(chǎn)生，收集含病毒的培養(yǎng)液，經(jīng)0.45 μm濾器過濾。將含有pLVX-DUSP2-FLAG和pLVX control的病毒液分別加入已預(yù)先鋪好MKN-45細胞的6孔板內(nèi)，48 h后換液，加入含嘌呤霉素的培養(yǎng)液進行篩選（2 mg/L），培養(yǎng)36 h，觀察細胞狀態(tài)，逐漸降低藥物濃度，最終維持在1 mg/L。選取穩(wěn)轉(zhuǎn)的細胞系進行后續(xù)實驗，細胞分組：實驗組為DUSP2穩(wěn)定過表達的胃癌MKN-45細胞，對照組為空載慢病毒轉(zhuǎn)染并篩選后的胃癌MKN-45細胞。

1.3 MTS細胞增殖實驗 分別計數(shù)實驗組和對照組細胞數(shù)，按每孔500個細胞接種于96孔板，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，向培養(yǎng)板中每孔加入20 μL MTS試劑，5%CO2、37℃孵箱中靜置1 h后使用Biotek酶標(biāo)儀檢測各樣本490 nm處的光密度（OD）值，每個樣品重復(fù)3次。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 實驗組和對照組分別取3×105個細胞，加入500 μL Binding Buffer懸浮，然后各加5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide混勻；室溫避光15 min后上機檢測：Q1區(qū)呈AnnexinⅤ-FITC陽性、PI陰性，為早期凋亡細胞；Q2區(qū)呈AnnexinⅤ-FITC陽性、PI陽性，為晚期凋亡細胞；Q3區(qū)呈AnnexinⅤ-FITC陰性、PI陽性，為機械性損傷細胞；Q4區(qū)呈AnnexinⅤ-FITC陰性、PI陰性，為活細胞。每組樣品重復(fù)3次，取均值進行統(tǒng)計分析。

1.5 實時定量PCR檢測DUSP2mRNA表達量 采用Trizol法抽提實驗組和對照組細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行PCR反應(yīng)，具體步驟及結(jié)果分析同1.2.2。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測目的蛋白表達量 提取實驗組和對照組細胞總蛋白，用BCA法測定總蛋白濃度。取35～40 μg總蛋白進行10%SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉；加入一抗孵育過夜（按體積比1∶1 000稀釋）；洗滌后加入二抗，孵育2 h（按體積比1∶5 000稀釋）；充分洗滌后用電化學(xué)發(fā)光法曝光檢測標(biāo)本膜上的信號，記錄實驗結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較采用Dunnett-t法，兩個樣本的組間比較采用獨立樣本的t檢驗，2組患者生存率比較采用Log-rank檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DUSP2表達與胃癌患者預(yù)后分析Kaplan–Meier分析表明DUSP2高表達的胃癌患者的生存率明顯優(yōu)于低表達患者（P＜0.05），見圖1。

2.2 實時定量PCR檢測DUSP2mRNA表達量 結(jié)果表明，DUSP2mRNA表達在對照及多種胃癌細胞中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

2.3 DUSP2過表達慢病毒載體的鑒定及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細胞系的建立pLVX-DUSP2-FLAG質(zhì)粒依次經(jīng)菌落篩選、陽性菌落擴增、提取質(zhì)粒、XbalⅠ、NotⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒的完整性和排除重組，鑒定結(jié)果與預(yù)期相符。最后進行DNA測序，測序結(jié)果與GenBank中人DUSP2基因序列完全相符。Western blot檢測FLAG的表達，結(jié)果顯示實驗組胃癌MKN-45細胞中可檢測到FLAG蛋白表達（圖3A），同時，實驗組的DUSP2mRNA水平較對照組明顯增高（n=3，t=19.365，P＜0.01），見圖3B。證實實驗組DUSP2過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的構(gòu)建成功。

Fig.1 Kaplan-Meier survival curves of gastric cancer patients with different expression levels of DUSP2圖1 DUSP2不同表達水平胃癌患者的生存曲線

Fig.2 The expressions of DUSP2 in gastric cancer cell lines圖2 DUSP2在不同胃癌細胞中的表達

Fig.3 The validation of DUSP2 overexpression stable cell line圖3 DUSP2過表達穩(wěn)定株的鑒定

2.4 DUSP2過表達抑制胃癌MKN-45細胞的增殖并促進凋亡MTS實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組細胞分別在24、48、72和96 h增殖能力均受到明顯抑制（均P＜0.05），見圖4。進一步用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測發(fā)現(xiàn)，實驗組細胞凋亡率明顯高于對照組細胞（n=3，t=4.325，P＜0.05），見圖5。

Fig.4 The effect of DUSP2 overexpression on MKN-45 cell proliferation圖4 DUSP2過表達對MKN-45細胞增殖的影響

Fig.5 The effect of DUSP2 overexpression on MKN-45 cell apoptosis圖5 DUSP2過表達對MKN-45細胞凋亡的影響

2.5 DUSP2過表達抑制ERK、P38磷酸化Western blot結(jié)果顯示，分別以總ERK、P38表達水平為對照，實驗組ERK、P38的磷酸化水平較對照組均顯著降低（n=3，t分別為16.393、7.936，P＜0.01），見圖6。

Fig.6 The effect of DUSP2 overexpression on phosphorylation of MAPK pathway圖6 DUSP2過表達對MAPK通路磷酸化水平的影響

3 討論

3.1 胃癌的臨床治療現(xiàn)狀 胃癌的治療主要以手術(shù)治療為主，其他綜合治療為輔。進展期胃癌患者約68%發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，常規(guī)治療后5年生存率約為30%左右［7-8］。早期胃癌患者通過外科手術(shù)治療效果相對理想，其5年生存率可以達到85%～95%［9］。但早期胃癌無明顯癥狀，大部分發(fā)現(xiàn)者已處于胃癌晚期，治愈較為困難。目前胃癌的傳統(tǒng)治療已不能滿足臨床患者的需求，亟需探索開發(fā)新的治療方法。近十年來關(guān)于腫瘤基因療法的研究已逐漸深入，研究胃癌不同發(fā)展階段的基因表達變化，可更好地幫助人們從分子層面了解胃癌的發(fā)病機制，進而為胃癌基因診斷和治療提供重要的理論依據(jù)。

3.2DUSP2基因的研究意義DUSP2又名PAC-1，是一種調(diào)控細胞增殖及凋亡的核特異性磷酸酶，其通過去磷酸化底物中絲氨酸或者蘇氨酸殘基從而使其失活［10］。最初研究發(fā)現(xiàn)其廣泛表達于淋巴組織，參與免疫調(diào)節(jié)等生理過程［11］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，DUSP2與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如在卵巢癌中，DUSP2高表達預(yù)示了更低的總體生存率［12］。而在急性白血病患者中，DUSP2的損失和持續(xù)的ERK激活密切相關(guān)，表明DUSP2可能起著抑癌基因的角色［13］。關(guān)于DUSP2在胃癌中的作用及相關(guān)分子機制目前鮮見相關(guān)報道。本研究結(jié)果表明，胃癌患者中DUSP2低表達預(yù)示生存率較差。在胃癌細胞中，通過MTS細胞增殖及凋亡實驗發(fā)現(xiàn)，DUSP2的過表達使胃癌細胞的增殖能力顯著下降，而相對應(yīng)的凋亡率增加，說明DUSP2表達上調(diào)可有效抑制胃癌細胞的增殖。此外，Western blot結(jié)果表明，實驗組的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路的重要介導(dǎo)者ERK和P38的磷酸化水平降低，說明DUSP2通過調(diào)控MAPK通路來發(fā)揮作用。上述結(jié)果驗證了DUSP2基因很可能作為抑癌基因之一，在胃癌的增殖、分化、侵襲過程中起到關(guān)鍵性的作用。

3.3 MAPK家族與腫瘤 眾所周知，MAPK是一類經(jīng)典的廣泛調(diào)控細胞增殖、分化、代謝、凋亡等一系列生理過程的激酶家族的統(tǒng)稱［14］。哺乳動物MAPK家族主要分3類：ERK、P38絲裂原活化蛋白激酶和C-Jun N末端激酶（JNK）［15］。目前，關(guān)于ERK信號通路在腫瘤中的作用主要體現(xiàn)在促細胞增殖方面，而JNK和P38除了參與促進腫瘤細胞的增殖，還介導(dǎo)細胞的凋亡［16］。研究表明，在胃癌發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移的過程中，ERK信號通路常被激活，而且P38通路的激活也與胃癌的形成有關(guān)［17］。DUSP2作為MAPK磷酸酶家族的重要一員，是公認的MAPK家族的主要負性調(diào)控者。本研究中，DUSP2的上調(diào)表達使胃癌細胞中ERK和P38的磷酸化水平明顯降低，具體的調(diào)控機制仍需深入研究。

綜上所述，DUSP2在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，該基因可能作為胃癌的抑癌基因和預(yù)后基因，為胃癌的臨床診斷和治療提供指導(dǎo)。