蒙麥俠，趙志國(guó)，陳志永，崔小敏

1.陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003),2.西安市碑林區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科(西安 710002)

主題詞 色譜法，高壓液相 正交試驗(yàn) 提取工藝 丹郁消癖顆粒

丹郁消癖顆粒處方來(lái)源于臨床乳腺?？拼蠓蚨嗄暧糜谥委熑橄僭錾?Hyperplasia of mammary gland,HMG)的經(jīng)驗(yàn)方。HMG是一種非炎癥又非腫瘤的良性乳腺疾病，是臨床常見的乳房疾病，該病好發(fā)于25～50歲的中青年婦女，發(fā)病率在育齡婦女中占40%左右，約占乳腺病的75%，居乳房疾病首位。隨著城市生活節(jié)奏加快、社會(huì)壓力增大、女性生活角色的轉(zhuǎn)變以及生育情況的影響，發(fā)病率呈逐年提高。乳腺增生分為典型性和非典型性增生，后者被業(yè)內(nèi)專家視為乳腺癌癌前病變的高度可疑信號(hào)[1-3]，因而引起相關(guān)醫(yī)學(xué)及女性朋友的普遍關(guān)注。

該藥處方由柴胡、丹參、益母草、赤芍、郁金、香附、莪術(shù)等藥味組成，具有疏肝理氣、活血化瘀，軟堅(jiān)散結(jié)之功，對(duì)肝郁氣滯、痰瘀互結(jié)型乳腺增生有很好的療效。乳腺增生病臨床多以3個(gè)月為1個(gè)治療周期，此方目前以湯劑形式用于臨床，給患者帶來(lái)服用量大、攜帶保存不便、依從性差、不能滿足長(zhǎng)時(shí)間服用等缺點(diǎn)，故確定結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)手段將其制成無(wú)糖型顆粒劑。試驗(yàn)設(shè)計(jì)中以君藥丹參中活血化瘀有效成分丹參素鈉的轉(zhuǎn)移率和干膏率為綜合考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選丹郁消癖顆粒的水煎提取工藝參數(shù)，為今后的規(guī)范化生產(chǎn)提供依據(jù)。

儀器與材料

1 儀 器 LC-2010A HT型高校液相色譜儀(島津公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BT 25S型電子分析天平(d=0.01 mg，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；溫控式電熱套(1000、2000 ml，鞏義市英峪予華儀器廠)。

2 材 料 丹參素鈉(批號(hào)：110855-201412)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所；丹參、益母草、赤芍、郁金、柴胡等藥材均購(gòu)自陜西興盛德藥業(yè)責(zé)任有限公司，經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院中藥鑒定與炮制研究室蒙麥俠副研究員鑒定均符合2015版中國(guó)藥典規(guī)定；甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

方法與結(jié)果

1 浸泡時(shí)間與吸水倍數(shù)考察 取試驗(yàn)處方量藥材，加適量水至液面高出藥材1 cm為止，記錄加入水的體積，總量為藥材量的6倍，每間隔一定時(shí)間觀察一次浸泡程度，待全方藥物浸透無(wú)干芯為止，記錄浸泡時(shí)間后，藥液濾過(guò)至盡，記錄傾出液體積。試驗(yàn)結(jié)果表明：浸泡時(shí)間為1 h，吸水倍數(shù)為1.3倍，由此確定正交試驗(yàn)加水倍數(shù)定為6、8、10倍。

吸水倍數(shù)=(加入水體積-傾出液體積)/藥材量

2 丹參素鈉含量測(cè)定[4-6]

2.1 溶液的制備：對(duì)照品溶液制備取丹參素鈉對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含0.151 mg的溶液，即得。

供試品溶液制備：按處方量稱取赤芍、柴胡、益母草、莪術(shù)等藥材，置回流提取器中，按文中表2安排的試驗(yàn)方案回流提取，提取液濾過(guò)，合并，濃縮至500 ml，精密量取各項(xiàng)下濃縮液50 ml，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量溶解并轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中，超聲處理30 min，放冷，定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

陰性樣品溶液制備：稱取處方量除丹參外的剩余藥材，加10倍量水煎煮3次，每次2 h，提取液濾過(guò)，合并，其余同供試品溶液處理方法處理，制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性：色譜柱：Inertsil ODS-3(4.6×250mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.5%冰醋酸溶液(7∶93)；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；流速：1.0ml/min；柱溫：35℃；理論塔板數(shù)：按丹參素鈉計(jì)不低于3000。

系統(tǒng)適用性:在上述色譜條件下吸取丹參素鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果陰性樣品色譜圖顯示在丹參素鈉出峰位置無(wú)相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，供試品色譜圖顯示丹參素鈉色譜峰和相鄰峰達(dá)到基線分離，表明選用的色譜條件適宜，陰性樣品對(duì)丹參素鈉的測(cè)定無(wú)干擾，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

2.3 測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算丹參素鈉含量，即得。

3 干膏率的測(cè)定 精密量取2.1項(xiàng)下的濃縮液50 ml，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，參照《中國(guó)藥典》2015版四部2201之浸出物測(cè)定法，在105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻0.5 h，迅速精密稱定重量，再干燥0.5 h，同前法放置及稱定重量，計(jì)算是否干燥達(dá)到恒重，否則，繼續(xù)干燥0.5 h，直至恒重，計(jì)算干膏重及提取干膏率。

干膏率=干膏重×10÷煎煮藥材量

4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[7-8]在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取加水量、煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)為考察因素，以干膏率和丹參素鈉含量為考察指標(biāo)，選用L9(34)正交試驗(yàn)表。按處方量稱取藥材，共9份，照表1因素水平表和表2正交實(shí)驗(yàn)安排進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，藥材加規(guī)定量水浸泡1 h后，提取相應(yīng)時(shí)間和次數(shù)，合并提取液，濾過(guò)，濃縮至500 ml后按照上述測(cè)定方法測(cè)定丹參素鈉含量和干膏率。正交試驗(yàn)因素水平見表1，干膏率方差分析見表2，丹參素鈉含量方差分析見表3，正交實(shí)驗(yàn)安排和數(shù)據(jù)分析見表4。

A-丹參素鈉標(biāo)準(zhǔn)品 B-供試品溶液 C-缺丹參陰性樣品溶液

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 干膏率方差分析表

注：F0.1(2，2)=9.00 F0.05(2，2)=19.00 F0.01(2，2)=99.00

表3 丹參素鈉含量方差分析表

注：F0.1(2，2)=9.00,F0.05(2，2)=19.00,F0.01(2，2)=99.00

從表2和表3數(shù)據(jù)可以得出：以干膏率為考察指標(biāo)，煎煮次數(shù)的影響有極顯著性影響意義，該因素的水平不可調(diào)整，加水量及提取時(shí)間的影響無(wú)顯著性意義；以丹參素鈉為考察指標(biāo)，加水量和煎煮次數(shù)對(duì)其提取量有影響，但沒(méi)有顯著性意義。綜合直觀及方差分析結(jié)果，確定最佳提取工藝為A3B3C3，即加10倍量水，煎煮3次，每次2 h。

5 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取處方量藥材，三份，加水浸泡1 h，加10倍量水，煎煮3次，每次2.0 h，煎煮液合并，濾過(guò)，濃縮至500 ml，下按“干膏率和丹參素鈉測(cè)定”方法進(jìn)行，計(jì)算干膏率和丹參素鈉含量，結(jié)果見表5，平均干膏率為26.85%，RSD為1.30%，丹參素鈉平均含量為146.61mg，RSD為2.06%，說(shuō)明優(yōu)選工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好。

表4 正交試驗(yàn)安排和數(shù)據(jù)分析表

從表4數(shù)據(jù)直觀分析可以得出各因素對(duì)干膏率的影響依次為：C>A>B，即煎煮次數(shù)>加水量>煎煮時(shí)間；對(duì)丹參素鈉提取量的影響依次為：A>C>B，即加水量>煎煮次數(shù)>煎煮時(shí)間；最優(yōu)工藝為：從干膏率考察指標(biāo)得出加10倍量水，煎煮2.0 h，煎煮3次；從丹參素鈉考察指標(biāo)得出加10倍量水，煎煮2.0 h，煎煮3次；兩者優(yōu)選出的結(jié)果一致。從直觀分析最終確定最優(yōu)提取工藝為：A3B3C3，即加10倍量水，煎煮3次，每次2 h。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

討 論

乳腺增生病是一種乳腺組織非炎性又非腫瘤的良性乳腺疾病?；颊咭匀橄倌[塊和脹痛為主要癥狀，是乳腺主質(zhì)或間質(zhì)不同程度地增生與復(fù)舊不全，造成乳腺結(jié)構(gòu)在數(shù)量及組織形態(tài)上表現(xiàn)異常的一類疾病，是以腺泡上皮、導(dǎo)管上皮及纖維結(jié)締組織增生為主要病理改變的乳房疾病。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為乳腺增生病主要由外界不良因素如長(zhǎng)期的精神緊張、過(guò)度勞累及晚婚晚育等而致使機(jī)體內(nèi)分泌紊亂所致，如雌二醇絕對(duì)或相對(duì)增高，孕酮分泌相對(duì)或絕對(duì)不足，導(dǎo)致E2/P比例失調(diào)，孕酮失去制約雌二醇與保護(hù)乳腺組織的作用，致使雌激素持續(xù)對(duì)乳腺組織不良刺激，從而引起乳腺增生病。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病屬于中醫(yī)的乳癖范疇，主要由人體臟腑、經(jīng)絡(luò)、氣血、津液、陰陽(yáng)失調(diào)而引起的生理功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生異常的一類疾病。乳房位于胸中，為“宗經(jīng)之所”；其中，足陽(yáng)明胃經(jīng)(乳中穴)貫乳中；足厥陰肝經(jīng)上貫膈，布胸肋，繞乳頭；足少陰腎經(jīng)從腎上貫肝膈，入肺中，支脈入胸中而與乳聯(lián)；足太陰脾經(jīng)上貫膈，經(jīng)于乳外測(cè)；任脈行于兩乳之間，沖脈挾臍上行，至胸中而散。因此生理上乳房受臟腑、經(jīng)絡(luò)、氣血、津液所養(yǎng)，在“腎-天癸-沖任”性軸的協(xié)調(diào)作用下完成各項(xiàng)生理功能。因此乳腺增生的發(fā)病與肝、脾、胃、腎經(jīng)及沖任二脈關(guān)聯(lián)最為密切，上述臟腑經(jīng)絡(luò)功能失調(diào)皆可治病。歷代中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為該病的病機(jī)主要責(zé)之于肝氣郁結(jié)、脾虛痰阻、腎陽(yáng)不足、沖任失調(diào)，進(jìn)而會(huì)使機(jī)體形成氣滯、痰凝、血瘀等癥狀。病位在肝脾腎，病性是本虛標(biāo)實(shí)，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)因虛致實(shí)、因?qū)嵍?、虛?shí)夾雜的復(fù)雜過(guò)程[9-10]。丹郁消癖顆粒處方重用活血理氣通絡(luò)之品，使患者氣滯可解，淤血可化，經(jīng)絡(luò)可暢，故活血化瘀藥在該方中起著重要作用。

丹參為丹郁消癖顆粒方中君藥，味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩之功，用于月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、癥瘕積聚、胸腹疼痛等；文獻(xiàn)資料[11-15]報(bào)道所含水溶性成分丹參素具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，抗血小板凝聚、動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成，促進(jìn)血管新生等作用，對(duì)于改善乳腺增生瘀血癥狀發(fā)揮重要療效，故工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)中對(duì)丹參素鈉含量和干膏率雙重指標(biāo)給以評(píng)價(jià)。工藝考察結(jié)果中分別以丹參素鈉和干膏率計(jì)算，優(yōu)選出的最佳提取工藝參數(shù)方向性一致，故未采用分值比來(lái)計(jì)算。最后綜合直觀分析和方差分析結(jié)果，確定提取工藝為處方藥材加10倍量水、浸泡1 h、提取3次，每次2 h，經(jīng)驗(yàn)證表明優(yōu)選工藝穩(wěn)定可行。