郭冰冰， 蔣新液， 裴晶晶， 章 恒， 邱 婷， 衛(wèi)雅蓉

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫婦幼保健院兒?？疲?江蘇 無(wú)錫 214000)

肥胖作為全球最常見(jiàn)的流行病之一，嚴(yán)重威脅人群的健康和生活質(zhì)量。大量研究表明肥胖是引發(fā)胰島素抵抗(insulin resistance，IR)的最主要因素，而IR是高血壓、2型糖尿病、高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化等代謝性疾病的基礎(chǔ)[1-2]。谷氨酰胺(L-glutamine，Gln)作為人體內(nèi)最為豐富的氨基酸之一，具有維持機(jī)體氮平衡、保護(hù)腸黏膜屏障及改善免疫功能等多種生理生化作用。Opara等[3]的研究表明補(bǔ)充谷氨酰胺會(huì)使高脂飲食(high-fat diet,HFD)的C57BL/6J小鼠體重顯著下降，同時(shí)改善了胰島素抵抗水平；然而，Bock等[4]的研究報(bào)道指出補(bǔ)充谷氨酰胺并不能改善小鼠胰島素抵抗水平及體重狀態(tài)。因此，Gln對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠體重增加和胰島素抵抗的改善作用還存在爭(zhēng)議，有必要進(jìn)行進(jìn)一步研究?；诖耍緦?shí)驗(yàn)用高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖和胰島素抵抗，同時(shí)進(jìn)行Gln干預(yù)，探討Gln預(yù)防給藥對(duì)小鼠體重和胰島素抵抗的影響，為其防治提供新的依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

60只無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)雄性C57BL/6野生型小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(京)2015-0001，4～5周齡，體重14～16 g，飼養(yǎng)于清潔動(dòng)物房，自由進(jìn)食，溫度19～25 ℃，濕度(50±10)%，12 h交替照明的晝夜節(jié)律。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2 主要試劑和儀器

Gln和丙氨酸(L-alanine,Ala)購(gòu)自Sigma；小鼠胰島素(insulin，INS)、瘦素(leptin，LEP)、脂聯(lián)素(adiponectin，APN)和胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(蘇州卡爾文生物科技有限公司)；谷氨酰胺和丙氨酸試劑盒(南京建成生物工程研究所)。FA2004N型電子分析天平(上海精密儀器儀表有限公司)；Universal 320 R型臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(Hettich)；血糖儀和血糖試紙(Roche)；酶標(biāo)儀(BioTek)。

3 方法

3.1分組與處理 實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照(normal control，NC)組、HFD組、HFD+Ala組和HFD+Gln組，每組15只； HFD+Ala組作為HFD+Gln組的對(duì)照。NC組給予普通飼料，其它3組給予高脂飼料。普通飼料配方為氨基酸12.6%、蔗糖13%、淀粉45.1%、麥芽糖糊精15%、纖維素5%、礦物質(zhì)3.5%、豆油4%、維生素1%、碳酸氫鈉0.7%和膽堿酒石酸鹽0.3%；高脂飼料配方為氨基酸16.2%、蔗糖25.7%、棕櫚酸18.3%、淀粉11.3%、麥芽糖糊精10.4%、纖維素6.4%、礦物質(zhì)4.5%、豆油2.3%、豬油2.6%、維生素1%、碳酸氫鈉0.5%和膽堿酒石酸鹽0.25%，購(gòu)于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥有限責(zé)任公司。HFD+Ala 和HFD+Gln組分別給予濃度為4%的丙氨酸和谷氨酰胺溶液，NC組和HFD組給予蒸餾水，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由攝食和飲水。每周測(cè)定小鼠體重1次，連續(xù)16周。

3.2實(shí)驗(yàn)指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)期間每周稱重小鼠體重并記錄，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)每組小鼠體重，禁食不禁水12 h測(cè)定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，剖腹取附睪脂肪墊并稱重。采集小鼠血液，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)小鼠血清INS、LEP、APN和GLP-1水平，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index，IRI)和胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)，IRI=INS(mIU/L)×FBG(mmol/L)/22.5，ISI=1/(INS×FBG)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SAS 9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間均值比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間均值兩兩比較采用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 谷氨酰胺對(duì)小鼠體重的影響

給予不同處理后，各組小鼠體重均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，且分別與HFD組和HFD+Ala組小鼠比較，NC組和HFD+Gln組小鼠體重增長(zhǎng)速度明顯緩慢，HFD+Gln組表現(xiàn)出對(duì)體重增加較好的控制作用。從第12周開(kāi)始，不同處理組小鼠體重的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，NC組體重增加明顯低于HFD組和HFD+Ala組(P<0.05)；并且至給藥16周，HFD+Gln組體重低于HFD組小鼠(P<0.05)，表現(xiàn)出良好的體重控制作用，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The changes of body weight in the mice with different treatments. Mean±SD.n=15.*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsHFD group；△P<0.05vsHFD+Ala group.

圖1各組小鼠的體重變化

2 谷氨酰胺對(duì)小鼠肝重、附睪脂肪墊質(zhì)量及其指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，NC組小鼠附睪脂肪墊重量和附睪脂肪墊指數(shù)均顯著低于其它3組(P<0.05)。HFD+Gln組附睪脂肪墊重量、附睪脂肪墊指數(shù)、肝重、肝臟指數(shù)與HFD組和HFD+Ala組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

3 各組小鼠FBG、INS、IRI和ISI的比較

與NC組比較，HFD組FBG、INS和IRI均明顯升高，ISI明顯降低(P<0.05);與HFD組比較，HFD+Gln組的FBG及IRI明顯下降,ISI明顯升高(P<0.05)。HFD+Gln組的IRI及ISI水平與NC組和HFD+Ala組比較差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見(jiàn)表2。

4 谷氨酰胺對(duì)小鼠APN、LEP和GLP-1的影響

與NC組比較，其它3組APN水平均顯著降低(P<0.05)，且其它3組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。HFD組的LEP水平顯著高于NC組(P<0.05)。與HFD組比較，HFD+Gln組的LEP水平明顯降低(P<0.05)。而4組小鼠血清GLP-1水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表1 谷氨酰胺對(duì)小鼠附睪脂肪墊重量、肝重及其指數(shù)的影響

*P<0.05vsNC group.

表2谷氨酰胺對(duì)小鼠FBG、INS、IRI和ISI的影響

Table 2. The effects of L-glutamine (Gln) on fasting plasma glucose (FBG), insulin (INS), insulin resistance index (IRI) and insulin sensitivity index (ISI) in the mice (Mean±SD.n=15)

GroupFBG (mmol/L)INS (mIU/L)IRIISINC6.32±0.9340.40±8.5911.50±3.78-5.51±0.33HFD8.80±0.51?53.17±8.31?20.81±3.60?-6.14±0.61?HFD+Ala 8.66±0.84?50.58±8.2419.41±2.36?-6.07±0.17?HFD+Gln 7.46±0.78?#△44.91±6.1015.02±3.50#-5.80±0.22#

*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsHFD group；△P<0.05vsHFD+Ala group.

表3谷氨酰胺對(duì)小鼠LEP、APN和GLP-1的影響

Table 3. The effects of L-glutamine (Gln) on leptin (LEP), adiponectin (APN) and glucagon-like peptide-1 (GLP-1) in the mice (Mean±SD.n=15)

GroupAPN (μg/L)LEP (μg/L)GLP-1 (pmol/L)NC78.26±14.18#△4.21±0.90#△5.26±0.89 HFD36.45±61.60?22.76±5.13?4.37±0.72 HFD+Ala 39.26±10.16?19.72±3.18?4.56±0.49HFD+Gln 47.08±11.50?15.90±2.62#4.93±0.77

*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsHFD group；△P<0.05vsHFD+Ala group.

討 論

隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展和人們生活方式的改變，肥胖和超重都以驚人的速度在全球范圍內(nèi)增長(zhǎng)。作為一種能量攝入和消耗不平衡造成的慢性疾病，可對(duì)包括心、腦、腎臟、肝臟等在內(nèi)的多個(gè)器官系統(tǒng)造成損傷，嚴(yán)重影響人類健康和阻礙社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展[5-6]。肥胖者糖、脂代謝紊亂和多種細(xì)胞因子、炎性因子的釋放增加，使得機(jī)體的主要代謝器官長(zhǎng)期處于低度炎癥狀態(tài)，降低了靶器官對(duì)胰島素的敏感性，從而形成胰島素抵抗及代謝改變綜合征。眾多報(bào)道顯示與正常體重人群相比，肥胖人群更容易伴有胰島素抵抗[7]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，高脂喂養(yǎng)小鼠體重、附睪脂肪含量顯著增加，F(xiàn)BG、INS、IRI和LEP水平也顯著升高，而ISI和血清APN水平顯著降低，提示高脂喂養(yǎng)小鼠已出現(xiàn)肥胖且肥胖小鼠發(fā)生了胰島素抵抗，與以往研究結(jié)果一致[8]。

谷氨酰胺是 L-谷氨酸經(jīng)γ-羧基?；傻囊环N中性多功能氨基酸，是人體最為豐富的非必需氨基酸之一，占人體內(nèi)氨基酸的60%，是目前廣泛應(yīng)用的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。多項(xiàng)研究表明補(bǔ)充谷氨酰胺會(huì)對(duì)機(jī)體的某些內(nèi)分泌激素和體質(zhì)量產(chǎn)生一定的影響。巴西的一項(xiàng)研究指出補(bǔ)充谷氨酰胺誘導(dǎo)肥胖大鼠脂肪細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，同時(shí)也觀察到大鼠脂肪量減少[9]。肥胖誘發(fā)胰島素抵抗，同時(shí)胰島素抵抗又進(jìn)一步促進(jìn)肥胖的發(fā)展，兩者相輔相承，形成惡性循環(huán)。該研究還發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充Gln組大鼠APN水平顯著增加，而LEP水平下降。然而，Badole等[10]發(fā)現(xiàn)口服谷氨酰胺能顯著降低糖尿病大鼠血糖，增加血漿和胰腺胰島素分泌及血漿和結(jié)腸中GLP-1的分泌。新近一項(xiàng)研究首次將谷氨酰胺應(yīng)用于6名意大利肥胖女性，結(jié)果表明在沒(méi)有改變飲食和運(yùn)動(dòng)習(xí)慣的情況下，每天補(bǔ)充0.5 g/kg的谷氨酰胺4周可使體重和腰圍顯著下降[11]。因此，Gln的代謝調(diào)節(jié)作用尚有爭(zhēng)議，造成結(jié)果不一致的原因可能與給藥劑量、給藥周期、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇不同等有關(guān)。

本次實(shí)驗(yàn)研究表明Gln干預(yù)組肥胖大鼠體重顯著低于HFD組小鼠，表現(xiàn)出良好的體重控制作用。同時(shí)肥胖大鼠FBG、血清LEP和IRI均出現(xiàn)顯著回降，血清APN顯著升高。這說(shuō)明Gln具有改善肥胖機(jī)體糖脂類代謝，升高APN水平，改善IR的作用，可能是谷氨酰胺減肥作用的機(jī)制之一。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺可有效增加GLP-1分泌和體內(nèi)胰島素水平，改善血糖水平[12-13]。GLP-1可通過(guò)多種途徑產(chǎn)生降低體重的作用，包括抑制胃腸蠕動(dòng)和胃液分泌，抑制食欲及攝食，延緩胃內(nèi)容物排空。此外，GLP-1還可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(特別是下丘腦)，從而使人體產(chǎn)生飽脹感和食欲下降。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示谷氨酰胺并沒(méi)有顯著增加小鼠GLP-1水平，與以往研究結(jié)果不同， GLP-1是否參與谷氨酰胺的減肥降糖作用有待于進(jìn)一步明確。

綜上所述，谷氨酰胺可能通過(guò)多種物質(zhì)協(xié)同作用，對(duì)體重和胰島素抵抗有良好的控制作用，為肥胖患者的治療提供了新思路。但對(duì)于谷氨酰胺確切的作用機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。