鄭 強， 楊遠(yuǎn)征， 陳志林， 鄭盼盼， 陳佩瑩， 孫廣曉， 劉建莉

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1全科醫(yī)學(xué)科， 2重癥醫(yī)學(xué)科， 3創(chuàng)傷與空難救援研究重點實驗室， 海南 ?？?570102)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstuctive pulmonary disease，COPD)是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病，其發(fā)病率和死亡率較高，已成為一個造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的公共衛(wèi)生問題[1]。世界衛(wèi)生組織的研究表明，COPD的死亡率居全球致死性疾病的第5位[2]。COPD在我國40歲以上人群的發(fā)病率較高，其中吸煙是誘發(fā)COPD最主要的危險因素[3]。COPD主要的病理變化是肺氣腫，主要表現(xiàn)為肺組織彈性降低，終末細(xì)支氣管遠(yuǎn)端過度膨脹、充氣和肺容積增大或同時伴有氣道壁破壞。肺氣腫的主要發(fā)病機制包括細(xì)胞凋亡、蛋白酶與抗蛋白酶平衡的破壞、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)[4]。內(nèi)皮素-1(endothelin-1, ET-1)是一種由內(nèi)皮細(xì)胞釋放的具有強烈收縮血管和支氣管的21肽，其作用具有持久性。肺是內(nèi)皮素作用的主要靶器官以及合成、代謝的場所。研究表明內(nèi)皮素-1與COPD的發(fā)生、發(fā)展具有密切關(guān)系[5]。本研究通過檢測內(nèi)皮素-1在吸煙者和COPD患者誘導(dǎo)痰中的表達(dá)量，以及通過構(gòu)建肺氣腫大鼠模型并采用內(nèi)皮素A受體拮抗劑進(jìn)行干預(yù)，探究內(nèi)皮素-1在COPD發(fā)生發(fā)展中的作用以及機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料和主要儀器

20只雄性SD大鼠購自Yison Bio。內(nèi)皮素-1檢測試劑盒購自上海研生生化試劑有限公司；內(nèi)皮素A受體拮抗劑BQ123購自Peptides International Inc.；內(nèi)皮素受體非選擇性拮抗劑波生坦(bosentan,Bos)購自Actelion Pharmaceuticals;BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自Thermo Fish Scientific;抗cleaved caspase-3單克隆抗體購自Cell Signaling Technology;抗GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)檢測試劑盒和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；明膠酶譜法所用緩沖液均為本實驗室保存；生物抗氧化能力(bioantioxidant power，BAP)檢測試劑盒購自Diacron International。光學(xué)顯微鏡購自O(shè)lympus；電泳儀購自Invitrogen；酶標(biāo)儀購自Bio-Rad。

2 研究對象

收集健康不吸煙者(30例)、健康吸煙者(30例)和COPD患者(29例)，相應(yīng)設(shè)為健康對照(healthy control)組、吸煙(smoking)組和COPD組。健康對照組平均年齡為(45.26±5.29)歲，無長期吸煙以及被動吸煙史；吸煙組平均年齡為(48.31±6.74)歲，吸煙史均超過10年；COPD組平均年齡為(53.80±9.26)歲，根據(jù)2007年《慢性阻塞性肺疾病診治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)患者，并無哮喘病史和其它肺部疾病，處于COPD的穩(wěn)定期。健康對照組和吸煙組患者均為2個月無呼吸系統(tǒng)疾病史，且均經(jīng)詢問、胸部X線、肺通氣功能檢查，確認(rèn)無其它異常。根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]的指示，實驗前15 min以霧化的形式吸入200 μg沙丁胺醇和7 mL 3%鹽水，待有痰時將其收集入干凈的培養(yǎng)皿中，置于4 ℃冰箱中保存。根據(jù)內(nèi)皮素-1檢測試劑盒說明書的指示進(jìn)行操作，檢測誘導(dǎo)痰中內(nèi)皮素-1的濃度。

3 方法

3.1肺氣腫模型的制備 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]制備肺氣腫大鼠模型。SD大鼠飼養(yǎng)在溫度約為20～25 ℃的室內(nèi)，保持良好的通風(fēng)，自由采食和飲水。采用內(nèi)皮素A受體拮抗劑BQ123和非選擇性拮抗劑Bos進(jìn)行干預(yù)，SD大鼠隨機分為4組：對照(control)組、香煙煙霧干預(yù)(cigarette intervented)組、選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑(antagonist)組和非選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑(non-selective antagonist)組。對照組為常規(guī)飼養(yǎng)的大鼠，香煙煙霧干預(yù)組、選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組和非選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組腹腔內(nèi)注射香煙煙霧提取物(紅塔山香煙由抽吸裝置連續(xù)抽吸注入PBS緩沖液)，每周注射 1 次，連續(xù)干預(yù)3周，成功建立大鼠肺氣腫模型；選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組采用腹腔內(nèi)注射BQ123 (1 mg·kg-1·d-1)，每天注射1次，連續(xù)干預(yù)3周；非選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組采用灌胃給藥Bos (100 mg·kg-1·d-1)。

3.2樣本的采集 于實驗開始后的第21天，以腹腔注射戊巴比妥鈉的方法麻醉大鼠，抽取5 mL下腔靜脈血，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，吸取上清，保存于-80 ℃冰箱中備用。結(jié)扎支氣管，快速切取肺組織，預(yù)冷的生理鹽水洗凈后，加入細(xì)胞裂解液溶解肺組織，制成組織勻漿，10 000 r/min離心10 min，吸取上清即提取的蛋白質(zhì)樣品，保存于-80 ℃冰箱中備用。

3.3Western blot檢測肺組織中cleaved caspase-3的蛋白水平 吸取3.2中提取的蛋白質(zhì)，采用BCA法檢測蛋白濃度，加入1倍體積的2×SDS緩沖液稀釋蛋白質(zhì)樣品，100 ℃煮至蛋白質(zhì)完全變性。采用1×SDS電泳緩沖液沖洗提前配制好的14%的SDS-PAGE上樣孔。將玻璃板固定于電泳槽的緩沖室中，加入1×SDS電泳液，吸取40 μg蛋白質(zhì)樣品加入樣品孔，120 V電壓電泳1.5 h，直至溴酚藍(lán)達(dá)到凝膠底部。切除多余凝膠，做好標(biāo)記。組裝轉(zhuǎn)膜裝置：負(fù)極-海綿-濾紙-凝膠-偏聚氟乙烯膜-濾紙-海綿-正極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，接入電源，25 V電轉(zhuǎn)移2 h。將攜帶目的蛋白的偏聚氟乙烯膜置于5%封閉液中，室溫封閉1 h；加入封閉液稀釋的Ⅰ抗，4 ℃過夜孵育。TBST洗滌6次，每次10 min,加入封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗，室溫，搖床上孵育1 h，Tris-HCl緩沖鹽溶液+Tween(TBST)洗滌6次，每次10 min,加入增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence, ECL)化學(xué)試劑盒A、B液進(jìn)行反應(yīng)，使用Quantity One 1-D Analysis Software 獲得凝膠成像并分析其灰度值。

3.4檢測肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloprotease，MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotease，MMP-9)的活性 采用明膠酶譜法檢測肺組織中MMP-2和MMP-9的活性。將配置好的10%SDS-PAGE(含0.1%明膠)置于電泳裝置中，加入1×SDS電泳緩沖液沖洗加樣孔，將攜帶凝膠電泳的玻璃板置于緩沖液室中，加入1×SDS電泳緩沖液并淹沒加樣孔，取40 μg蛋白質(zhì)樣品加入上樣孔，125 V恒定電壓電泳1.5 h，直至藍(lán)色條帶遷移至凝膠底部。將凝膠置于洗脫液中振蕩洗脫2次，每次30 min,然后置于漂洗液中漂洗每次20 min，洗2次，置于孵育液中37 ℃孵育過夜，考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色3 h，加入脫色液A、B、C分別脫色0.5 h、1 h和2 h，藍(lán)色背景上的透明條帶即為MMP-2 (72 kD)和MMP-9 (92 kD)，凝膠成像系統(tǒng)分析其面積、寬度、灰度值。

3.5ELISA法檢測肺組織勻漿離心上清液中TNF-α和IL-1β的濃度 嚴(yán)格根據(jù)其ELISA檢測試劑盒說明書的指示進(jìn)行操作。

3.6檢測血清抗氧化能力 根據(jù)BAP檢測試劑盒說明書的指示檢測大鼠血清抗氧化能力。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間差異行Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 誘導(dǎo)痰中內(nèi)皮素-1的濃度

吸煙組和COPD組誘導(dǎo)痰中內(nèi)皮素-1的濃度較健康對照組顯著增加(P<0.05);與吸煙組相比，COPD組誘導(dǎo)痰中內(nèi)皮素-1的濃度顯著增高(P<0.05)，表明內(nèi)皮素-1參與COPD的發(fā)生發(fā)展,見圖1。

Figure 1. The concentration of endothelin-1 in induced sputum. Mean±SD.*P<0.05vshealthy control group;#P<0.05vssmoking group.

圖1誘導(dǎo)痰中內(nèi)皮素-1的濃度

2 各組大鼠肺組織中MMP-2和MMP-9活性及cleaved caspase-3蛋白水平的檢測

如表1所示，香煙干預(yù)組大鼠肺組織中MMP-2和MMP-9的活性較對照組顯著增加(P<0.05)，選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組和非選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組中MMP-2和MMP-9活性較香煙干預(yù)組顯著降低(P<0.05)；選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組和非選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組間MMP-2和MMP-9活性差異不具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

香煙干預(yù)組大鼠肺組織中cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)量較對照組明顯增多(P<0.05);選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組和非選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)較香煙干預(yù)組明顯降低(P<0.05)，見圖2、表1。

Figure 2. The protein level of cleaved caspase-3 in the lung tissues of the rats determined by Western blot.

圖2Westernblot檢測大鼠肺組織中cleavedcaspase-3的蛋白水平

3 大鼠肺組織勻漿上清液中TNF-α和IL-1β的濃度比較

如表2所示，香煙干預(yù)組大鼠肺組織勻漿上清液中TNF-α和IL-1β的濃度較對照組顯著增加(P<0.05);選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組和非選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組TNF-α和IL-1β的濃度較香煙干預(yù)組顯著減少(P<0.05)；選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組和非選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組間TNF-α和IL-1β濃度的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。

表1大鼠肺組織中MMP-2、MMP-9活性和cleavedcaspase-3蛋白水平的檢測

Table 1. The activity of MMP-2/MMP-9 and the protein level of cleaved caspase-3 in the lung tissues of the rats (Mean±SD.n=5)

GroupMMP-2MMP-9Cleaved caspase-3Control0.986±0.0850.962±0.0910.965±0.083Cigarette intervented1.952±0.257?1.853±0.263?2.457±0.486?Antagonist1.124±0.226#0.983±0.089#1.014±0.377#Non-selective antagonist0.953±0.096#0.876±0.092#0.985±0.089#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscigarette intervented group.

4 大鼠血清抗氧化能力的比較

如表2所示，香煙干預(yù)組大鼠血清BAP較對照組顯著降低(P<0.05)，選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組和非選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組大鼠血清BAP較香煙干預(yù)組顯著增加(P<0.05)；選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組和非選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑組間大鼠血清BAP的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。

表2大鼠肺組織勻漿上清液中TNF-α和IL-1β濃度及血清抗氧化能力的比較

Table 2. The concentrations of TNF-α and IL-1β in rat lung tissue supernatant and the serum level of bioantioxidant power (BAP) (Mean±SD.n=5)

GroupTNF-α (ng/g)IL-1β (ng/g)BAP (μmol/L)Control9.268±1.126125.323±32.7452 351.14±325.69Cigarette intervented14.587±2.365?263.187±43.856?1 238.54±276.28?Antagonist9.560±1.252#135.685±37.368#2 598.47±396.60#Non-selective antagonist 8.963±1.032#123.585±40.223#2 235.24±342.37#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscigarette intervented group.

討 論

COPD是一種不完全可逆的氣流受限為特征的肺部疾病，氣流受限通常呈進(jìn)行性發(fā)展,并與肺對香煙煙霧等有害顆?；驓怏w的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[8]。COPD是一種可以預(yù)防和治療的慢性氣道炎癥性疾病，吸煙被認(rèn)為是主要的誘導(dǎo)因素之一。內(nèi)皮素-1是目前作用效果最強和持久的血管收縮劑，同時具有促細(xì)胞分裂的功能。內(nèi)皮素-1主要通過特異性受體參與血管收縮、成纖維細(xì)胞分裂、炎癥反應(yīng)過程，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用[9-11]。內(nèi)皮素-1受體作用范圍較廣，分為A受體和B受體。內(nèi)皮素-1A受體分布于平滑肌細(xì)胞中，調(diào)控血管收縮過程；B受體多分布于內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞中，調(diào)控血管舒張過程。內(nèi)皮素-1促進(jìn)或者抑制細(xì)胞凋亡的作用主要取決于細(xì)胞的種類和特異性表達(dá)A受體/B受體的多少[12]。研究表明，內(nèi)皮素-1廣泛參與呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制，具有重要的生理功能[13]。有文獻(xiàn)報道表明，小肺內(nèi)動脈暴露于煙霧中可使內(nèi)皮素-1的表達(dá)量增加[14]。在本文的研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮素-1在吸煙者和COPD患者中的表達(dá)量顯著高于健康對照組，但內(nèi)皮素-1在COPD患者中的表達(dá)量高于吸煙者，表明內(nèi)皮素-1在COPD的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，但其具體作用機制并不清楚。

阻塞性肺氣腫簡稱為肺氣腫，是COPD的主要病理變化，同時也是研究COPD發(fā)病機制的熱點之一。細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、蛋白酶失衡、氧化應(yīng)激在肺組織保持完整結(jié)構(gòu)的過程中起著重要作用，與肺氣腫和COPD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15-17]。Caspase蛋白家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)對細(xì)胞凋亡過程起著重要作用。Caspase-3是其級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵因子，在細(xì)胞凋亡過程中執(zhí)行關(guān)鍵作用。基質(zhì)金屬蛋白酶通過降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，在肺氣腫的發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與COPD的形成有關(guān)。研究表明，肺氣腫患者的誘導(dǎo)痰中MMP-2和MMP-9的活性明顯增加[18]。既往研究表明，許多淋巴細(xì)胞和炎癥因子參與COPD的形成過程，破壞氣道壁和肺組織的完整性，從而誘導(dǎo)肺氣腫的產(chǎn)生[19]。研究表明，炎癥介質(zhì)比如TNF-α和IL-1β能夠促進(jìn)COPD氣道炎癥反應(yīng)從而誘導(dǎo)氣道重塑[20]。為了探究內(nèi)皮素-1在COPD中的具體作用，本研究通過構(gòu)建肺氣腫大鼠模型，結(jié)果顯示，香煙煙霧提取物可使大鼠肺組織中cleaved caspase-3蛋白水平、MMP-2和MMP-9的活性、上清液TNF-α和IL-1β的含量顯著增加；內(nèi)皮素A受體選擇性和非選擇性拮抗劑均能顯著抑制肺組織中cleaved caspase-3蛋白水平、MMP-2和MMP-9的活性、上清液TNF-α和IL-1β的含量；香煙煙霧提取物抑制大鼠抗氧化能力，內(nèi)皮素A受體選擇性和非選擇性拮抗劑均能促進(jìn)大鼠抗氧化能力。這些結(jié)果提示內(nèi)皮素-1可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、基質(zhì)金屬蛋白酶活性、炎癥以及氧化應(yīng)激反應(yīng)參與COPD發(fā)生、發(fā)展過程。

總之，內(nèi)皮素-1在COPD患者中的表達(dá)量上調(diào)，可能通過調(diào)控細(xì)胞凋亡、基質(zhì)金屬蛋白酶動態(tài)平衡以及炎癥、氧化應(yīng)激過程參與肺氣腫的病理機制，為內(nèi)皮素-1受體拮抗劑用于緩解COPD的可能性提供了新的理論依據(jù)，但其具體的作用機制尚需進(jìn)一步的研究。