王進峰, 舒文云, 祝宏斌, 鄺乾華
(浙江衢化醫(yī)院泌尿外科, 浙江 衢州 324004)
在男性群體中,前列腺癌是臨床上發(fā)病率占第二位的惡性腫瘤,嚴重威脅男性健康和生活質量[1-2]。目前,對于早期前列腺癌,手術切除腫瘤組織是臨床上最有效的治療方法,但對于中、晚期前列腺癌患者而言,由于腫瘤細胞的擴散,患者需要進行系統(tǒng)性化療以提高其生活質量和生存率[3-4]。然而,很多患者體內(nèi)的腫瘤細胞對化療藥物并不敏感,因此在化療過程中聯(lián)合一些輔助治療藥物提高腫瘤細胞的化療敏感性是改善抗腫瘤治療的重要策略。
順鉑(cisplatin)有較強的廣譜抗腫瘤作用,具有細胞毒性,是治療前列腺癌的常規(guī)化療藥物。順鉑在腫瘤細胞中能與DNA結合,引起交叉聯(lián)結,從而破壞DNA的功能,激活腫瘤細胞的凋亡途徑,使其發(fā)生凋亡性死亡[5-7]。然而順鉑的副作用較大,大劑量使用具有明顯的腎毒性和耳毒性,且隨著順鉑的持續(xù)使用,前列腺癌細胞會逐漸形成對順鉑的耐藥性[8-10],因此采取輔助治療手段提高前列腺癌細胞對順鉑的化療敏感性具有十分重要的臨床意義。
二氫楊梅素(dihydromyricetin)又名蛇葡萄素,是一種具有很強藥理活性的黃酮類化合物,具有解除醇中毒和抑制細胞惡變的作用,文獻報道二氫楊梅素還有一定的抗腫瘤活性[11-12],然而其是否能增強順鉑的抗前列腺癌活性至今仍很少報道。本研究的目的在于探討二氫楊梅素對前列腺癌順鉑化療的輔助作用并研究其機制。
人前列腺癌細胞系PC3和LNCaP購于美國模式培養(yǎng)物保存中心(American Type Culture Collection,ATCC),培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5% CO2。
順鉑、二氫楊梅素、MTT和凋亡檢測試劑盒購于Sigma-Aldrich;DMEM培養(yǎng)基購于Gibco;蛋白提取液,以及抗FOXO1、Bim、Noxa、caspase-9、caspase-3、凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease-activating factor-1, Apaf-1)、細胞色素C (cytochrome C)和GAPDH抗體購于Cell Signaling Technology;線粒體分離試劑盒購于碧云天生物科技有限公司;蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠和FOXO1小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)購于Santa Cruz;ECL顯色試劑盒購于Pierce;Lipofectamine 2000購于Invitrogen。
3.1FOXO1基因沉默 將PC3細胞接種在6孔板中孵育過夜,使其貼壁。將50 nmol/LFOXO1 siRNA用Lipofectamine 2000進行包裹后將其加入到無血清培養(yǎng)基進行混合。吸取原6孔板中的培養(yǎng)基,并將上述含F(xiàn)OXO1 siRNA的無血清培養(yǎng)基加入到6孔板中。細胞孵育6 h后吸去無血清培養(yǎng)基,并加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。對照組細胞采用Lipofectamine 2000(含無關siRNA)孵育6 h。
3.2細胞活力的檢測 將常規(guī)PC3細胞、LNCaP細胞和FOXO1基因沉默的PC3細胞按每孔5×103接種在96孔板中孵育過夜,后加入順鉑(0、1、2、5、10、15、20和30 μmol/L)和二氫楊梅素(0、5、10、50、100和200 μmol/L)處理細胞48 h,之后加入20 mL MTT(5 g/L)37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,移除孔內(nèi)培養(yǎng)基,加入100 μL二甲亞砜,充分振蕩混勻后在570 nm波長下測定吸光度(A)。細胞活力結果用藥物處理組與對照組的A值比值表示。
3.3線粒體分離 轉染后的PC3細胞經(jīng)順鉑(2 μmol/L)和二氫楊梅素(10 μmol/L)聯(lián)合處理48 h后,用線粒體分離試劑盒按說明所示步驟分離移除PC3細胞中的線粒體,收集無線粒體的細胞質用以檢測其中的細胞色素C。
3.4Western blot實驗 轉染后的PC3細胞經(jīng)順鉑(2 μmol/L)和二氫楊梅素(10 μmol/L)聯(lián)合處理48 h后,用蛋白提取液提取PC3細胞中的總蛋白。在等量的總蛋白質中加入上樣緩沖液后用10% SDS-PAGE進行分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質從分離膠上轉到PVDF膜上,用5%脫脂奶粉對PVDF膜進行封閉孵育2 h。加入抗FOXO1、Bim、Noxa、caspase-9、caspase-3、Apaf-1、cytochrome C和GAPDH的 I 抗對PVDF膜進行孵育過夜,后再用帶辣根過氧化物酶的 II 抗孵育2 h,蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。
3.5免疫共沉淀 轉染后的PC3細胞經(jīng)順鉑(2 μmol/L)和二氫楊梅素(10 μmol/L)處理48 h后,用蛋白提取液對PC3細胞進行裂解。裂解后的細胞在12 000 r/min下離心10 min,收取上清液分成等量2份,一份直接進行Western blot實驗作為對照(input),另外一份加入Apaf-1抗體孵育過夜,孵育完成后在該體系中加入蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠孵育2 h。之后在共沉淀產(chǎn)物中加入上樣緩沖液并煮沸除去瓊脂糖珠后進行Western blot實驗,檢測與Apaf-1結合的caspase-9蛋白。
3.6細胞凋亡實驗 轉染后的PC3細胞經(jīng)順鉑(2 μmol/L)和二氫楊梅素(10 μmol/L)處理48 h后按說明書步驟用凋亡檢測試劑盒檢測細胞的凋亡情況,用流式細胞術進行分析,Annexin V陽性細胞即為凋亡細胞。
統(tǒng)計分析軟件為SPSS 15.0。所有實驗重復3次,實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),行Bonferroni校正進行多組間均數(shù)的兩兩比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
MTT實驗結果顯示,二氫楊梅素單獨處理對PC3和LNCaP細胞的殺傷活性都較弱,見圖1A、B,然而較低濃度的二氫楊梅素(10 μmol/L)聯(lián)合處理卻能顯著提高不同濃度順鉑(0~30 μmol/L)對前列腺癌細胞系PC3和LNCaP的殺傷活性(P<0.05),表明二氫楊梅素輔助治療能明顯增強前列腺癌細胞對順鉑的敏感性,見圖1C、D。在對PC3的聯(lián)合治療中,二氫楊梅素(10 μmol/L)聯(lián)合較低濃度順鉑(2 μmol/L)已能顯著殺傷腫瘤細胞,因此選擇該濃度藥物進行機制研究。
Figure 1. Dihydromyricetin enhanced the cytotoxicity of cisplatin against prostate cancer cells. A: cytotoxicity of dihydromyricetin (0~200 μmol/L) against PC3 cells; B: cytotoxicity of dihydromyricetin (0~200 μmol/L) against LNCaP cells; C: dihydromyricetin (10 μmol/L) increased the cytotoxicity of different concentrations of cisplatin (0~30 μmol/L) against PC3 cells; D: dihydromyricetin (10 μmol/L) increased the cytotoxicity of different concentrations of cisplatin (0~30 μmol/L) against LNCaP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖1二氫楊梅素增強順鉑對前列腺癌細胞的殺傷活性
Western blot實驗結果顯示,二氫楊梅素能明顯誘導PC3細胞中FOXO1的表達(P<0.05),表明FOXO1是二氫楊梅素的作用靶點,見圖2A。MTT實驗結果顯示,盡管二氫楊梅素輔助治療能明顯提高順鉑的抗前列腺癌活性,然而轉染FOXO1 siRNA后,二氫楊梅素對順鉑的協(xié)同作用受到明顯抑制(P<0.05),提示二氫楊梅素通過上調前列腺癌細胞中FOXO1的表達提高其對順鉑化療的敏感性,見圖2B。另外,Western blot實驗結果顯示二氫楊梅素聯(lián)合順鉑能顯著誘導PC3細胞中促凋亡蛋白Noxa和Bim的表達,而轉染FOXO1 siRNA后,兩者聯(lián)合誘導的Noxa和Bim的過表達受到顯著抑制(P<0.05),提示二氫楊梅素可能通過FOXO1-Noxa/Bim途徑促進順鉑誘導的凋亡通路,見圖2C。
Figure 2. Dihydromyricetin-promoted death of cisplatin-treated PC3 cells was dependent on the FOXO1 pathway. A: dihydromyricetin decreased the expression of FOXO1 in PC3 cells; B:FOXO1 siRNA suppressed the promotion of dihydromyricetin on cisplatin-induced death of PC3 cells; C: combination of dihydromyricetin and cisplatin induced overexpression of Noxa and Bim in PC3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vscisplatin group;#P<0.05vscisplatin+dihydromyricetin group.
圖2二氫楊梅素提高順鉑對PC3細胞的殺傷活性依賴于FOXO1途徑
鑒于二氫楊梅素聯(lián)合順鉑能顯著誘導PC3細胞中促凋亡蛋白Noxa和Bim的表達,本研究進一步探討兩者聯(lián)合對PC3細胞凋亡通路的影響。Western blot實驗結果顯示,二氫楊梅素聯(lián)合順鉑處理的PC3細胞的細胞質中細胞色素C蛋白水平顯著升高(P<0.05),表明二氫楊梅素聯(lián)合順鉑能顯著誘導PC3細胞的細胞色素C從線粒體中釋放到細胞質中,見圖3A。免疫共沉淀實驗結果顯示,二氫楊梅素輔助治療能明顯促進順鉑誘導的Apaf-1和caspase-9的相互作用(P<0.05),見圖3B。
在其下游凋亡信號通路中,實驗結果顯示二氫楊梅素聯(lián)合順鉑顯著誘導PC3細胞發(fā)生caspase-9和caspase-3的活化(P<0.05),見圖3C,并最終導致其發(fā)生顯著的凋亡(P<0.05),見圖3D。這些實驗結果表明二氫楊梅素能通過FOXO1-Bim/Noxa途徑增強順鉑對前列腺癌細胞的凋亡誘導活性。
二氫楊梅素是一種天然黃酮類有效成分,具有抗氧化、抗血栓和抗炎作用。近期的研究發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素還具有一定的抗腫瘤活性,如二氫楊梅素能通過抑制肝癌細胞中MMP-9蛋白的表達抑制其轉移和侵襲能力[13],又如二氫楊梅素能通過ROS-STAT3信號通路促進頭頸癌細胞的凋亡和自噬[14],然而二氫楊梅素在前列腺癌細胞中的生物學活性及其對順鉑化療的協(xié)同效應至今仍很少報道。順鉑是治療前列腺癌的重要化療藥物,研究表明順鉑能誘導腫瘤細胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡[15],然而順鉑的副作用較大,大劑量的使用具有明顯的腎毒性和耳毒性,且一些前列腺癌細胞對順鉑治療的敏感性較低,因此采取輔助治療手段降低順鉑的使用劑量并提高其抗腫瘤活性十分重要。
Figure 3. Combination of dihydromyricetin and cisplatin induced mitochondrial apoptosis in PC3 cells. A: dihydromyricetin promoted release of cytochrome C in cisplatin-treated PC3 cells; B: dihydromyricetin promoted the interaction of Apaf-1 and caspase-9 in cisplatin-treated PC3 cells; C: dihydromyricetin promoted cleavage of caspase-9 and caspase-3 in cisplatin-treated PC3 cells; D: dihydromyricetin significantly enhanced the cisplatin-induced apoptosis in PC3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vscisplatin group;#P<0.05vscisplatin+dihydromyricetin group.
圖3二氫楊梅素聯(lián)合順鉑誘導PC3細胞發(fā)生線粒體途徑凋亡
在本研究中,預實驗結果發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素單獨治療對前列腺癌細胞的殺傷活性較弱,較高濃度仍不能達到理想的抗腫瘤效果。然而較低濃度的二氫楊梅素(10 μmol/L)即能明顯增強各種濃度順鉑的抗前列腺癌活性,使較低濃度的順鉑(2 μmol/L)也能對前列腺癌細胞產(chǎn)生顯著的殺傷活性,表明二氫楊梅素對前列腺癌的順鉑化療有協(xié)同效應。
FOXO1是一個很重要的轉錄因子,參與細胞中各種生理活動,包括DNA修復、細胞周期的轉換遞進和凋亡信號的傳遞。FOXO1已經(jīng)被證實是一種腫瘤抑制性分子,腫瘤細胞中FOXO1表達的缺失將促進腫瘤的發(fā)生和惡性細胞的增殖[16-17]。此外,F(xiàn)OXO1還能增強一些下游促凋亡基因,如Noxa和Bim的轉錄活性,因此FOXO1的過表達能促進腫瘤細胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡[18-19]。本研究的機制性實驗結果表明二氫楊梅素能明顯提高前列腺癌細胞中FOXO1蛋白的表達水平,從而增強了前列腺癌細胞中Noxa和Bim基因的轉錄活性,使腫瘤細胞在順鉑的治療下能發(fā)生Noxa和Bim的過表達,進而誘導前列腺癌細胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡,表現(xiàn)為細胞色素C從線粒體中釋放到細胞質中,并在細胞色素C的參與下,Apaf-1與caspase-9發(fā)生相互作用使之活化,再通過下游分子caspase-3的參與最終使前列腺癌細胞發(fā)生凋亡性死亡。
綜上所述,本研究證明了二氫楊梅素能顯著增強順鉑的抗前列腺癌活性并研究了其機制。這些研究為提高化療藥物的臨床療效并降低其使用劑量提供了新的策略和思路。