季 娜， 鐘樹志， 張根葆

(皖南醫(yī)學(xué)院 1組織胚胎學(xué)教研室， 2病理與病理生理學(xué)教研室， 安徽 蕪湖 241000)

血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelia cells，VECs)為襯貼于心血管內(nèi)腔面的單層扁平細(xì)胞，是血管壁與血液之間的分界屏障細(xì)胞。目前，人們認(rèn)為VECs的生物學(xué)功能除了作為屏障外，還具有活躍的代謝功能和一定的抗栓功能，在凝血與抗凝及血液的流動性等方面具有調(diào)節(jié)作用。血管內(nèi)皮的損傷與功能異常與多種疾病的發(fā)生相關(guān)，尤其在血栓性疾病發(fā)病過程中起到重要作用，在血管壁受損和內(nèi)毒素等外部因素作用下，其抗栓能力減弱，血栓易在血管壁形成。

蛇毒是一類天然混合毒素，含有多種活性成分，研究表明其可以影響神經(jīng)和血液等多個系統(tǒng)，還可以直接抑制血小板聚集，防止血栓形成[1]。de Sousa等[2]從矛頭蛇毒中分離純化出的血小板聚集抑制因子，干擾了血管性血友病因子(von willebrand factor, vWF)與血小板膜糖蛋白Ib的相互作用，阻礙血小板的黏附；Chen等[3]從蘄蛇毒水解物中提取Xa因子抑制肽，能夠抑制ADP引起的血小板聚集，發(fā)揮抗栓作用。有報道指出，蛇毒中同樣含有血管內(nèi)皮保護成分，作用于血管內(nèi)皮，影響炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子對血管內(nèi)皮的損害[4]。本研究所已成功從蝮蛇毒中分離出抑制血小板聚集的組分，實驗證實這些組分能夠防治血栓的形成[5-6]。通過3次柱層析分離純化粗毒，得到一活性組分為蝮蛇毒血小板抑制因子(platelet inhibitor fromAgkistrodonhalysvenom，AHV-PI)。前期研究表明[7]，AHV-PI能抑制ADP引起的血小板活化和聚集，其作用機制可能是通過保護血小板超微結(jié)構(gòu)，減少血小板脂質(zhì)代謝和顆粒內(nèi)容物的釋放有關(guān)，但是否通過影響內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)或功能來發(fā)揮抗血小板作用，目前仍然不明確，本研究將對此進行探討。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

1.1細(xì)胞株 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)由南京凱基生物公司提供。

1.2藥品與試劑 AHV-PI 由皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所提供，相對分子量為31 kD；胎牛血清(杭州四季青公司)；PBS緩沖液和DMEM完全培養(yǎng)基(Thermo)；流式凋亡試劑盒(南京凱基生物)；0.25% 胰酶+0.02% EDTA和 NF-κB試劑盒(江蘇碧云天)；MTT、細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和DMSO(Sigma)；組織因子(tissue factor，TF)和細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)ELISA試劑盒(武漢華美)；抗纖溶酶原激活物抑制物1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)和組織型纖溶酶原激活物(tissue type plasminogen activator，t-PA)抗體及免疫組化相關(guān)試劑(武漢博士德)；本實驗中用到的其它試劑均為分析純。

1.3儀器 超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊)；倒置相差顯微鏡(Olympus)；離心機(Eppendorf)；5% CO2培養(yǎng)箱和-80 ℃超低溫冰箱(Thermo)；酶標(biāo)儀(TECAN)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs懸于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2、95%空氣，保持一定濕度)，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，根據(jù)細(xì)胞生長情況，1～2 d給予換液，用0.25%胰酶+0.02% EDTA消化，按1∶2或1∶3傳代。傳代至3～5代，選取形態(tài)正常、活力旺盛的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

2.2分組與給藥 實驗分為4組：空白對照(control)組、LPS(1 mg/L)組、AHV-PI組和AHV-PI+LPS組?？瞻讓φ战M加入等體積的DMEM培養(yǎng)基，AHV-PI組加入濃度梯度為0.32、0.64、1.25、2.5、5、10和20 mg/L的AHV-PI， AHV-PI+LPS組分別加入0.32、0.64、1.25、2.5、5、10和20 mg/L的AHV-PI和1 mg/L LPS的混合液。

2.3MTT法測定AHV-PI對HUVECs活力的影響 將細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中，待鋪板率達80%左右時棄去培養(yǎng)液。按上述分組給藥，每個濃度組設(shè)5個復(fù)孔，分別孵育6 h、12 h和24 h后，每孔加入終濃度為5 mg/L 的MTT(20 μL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后加入150 μL DMSO，振蕩搖勻10 min，在490 nm處測定吸光度(A)值，反映細(xì)胞活力。

2.4倒置顯微鏡觀察各組HUVECs的形態(tài)變化 將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，待鋪板率達80%左右時棄去培養(yǎng)液，按上述分組給藥，孵育24 h后鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化。

2.5Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期HUVECs，棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，按分組加藥后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，取出培養(yǎng)瓶，PBS洗滌、消化完畢后，加入培養(yǎng)液終止消化。2 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞并計數(shù)，收集1×105個重懸的細(xì)胞，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μL PI混勻。室溫避光反應(yīng)10 min左右，隨即上流式細(xì)胞儀檢測。

2.6免疫組化檢測t-PA和PAI-1表達 細(xì)胞分組處理12 h后，采用4%多聚甲醛固定30 min，3% H2O2浸泡30 min，按SABC試劑盒要求加入A液封閉，加入 I 抗4 ℃過夜；分別加入B液和C液；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片后于顯微鏡下觀察。

2.7ELISA法檢測細(xì)胞上清液ICAM-1和TF的含量 按照ELISA試劑盒說明書進行加樣，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，酶標(biāo)儀測450 nm處A值。

2.8免疫熒光染色檢測NF-κB 各實驗組細(xì)胞分別加藥孵育4 h后，吸除培養(yǎng)液，PBS洗滌，固定10 min，封閉1 h，加入抗NF-κB p65抗體，4 ℃孵育過夜，洗滌后加入抗兔Cy3 Ⅱ抗，室溫孵育1 h，洗滌后加入細(xì)胞核染色液(DAPI)，室溫染色5 min，洗滌，加抗熒光淬滅劑封片。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多樣本組間滿足正態(tài)性，采用單因素方差分析,并用SNK-q檢驗作兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AHV-PI對HUVECs活力的影響

由表1可見，同一時點，AHV-PI低于5 mg/L時，A值與對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，孵育24 h后A值較6 h和12 h有所上升。AHV-PI濃度大于5 mg/L時，與對照組相比， 隨著AHV-PI濃度的增加，HUVECs的A值減小(P<0.05)，細(xì)胞活力下降，由此篩選出AHV-PI的最適濃度為5 mg/L。

表1 不同濃度AHV-PI對HUVECs活力的影響

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs6 h；△P<0.05vs12 h group.

2 AHV-PI減輕LPS誘導(dǎo)的HUVECs損傷

從表2可以看出，同一時點內(nèi)，與對照組比較，LPS組的A值顯著降低(P<0.05)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷較明顯；與LPS組相比，加入AHV-PI濃度為5 mg/L時能夠顯著提高A值，抑制LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷(P<0.05)。AHV-PI(5 mg/L)+LPS組24 hA值較6 h和12 h明顯上升。

表2 AHV-PI對LPS誘導(dǎo)HUVECs損傷的作用

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05vs24 h group.

3 AHV-PI對各實驗組HUVECs形態(tài)的影響

AHV-PI濃度5 mg/L以下時對HUVECs的形態(tài)無明顯改變，細(xì)胞多為圓形、橢圓形或梭形，細(xì)胞邊界清晰，胞漿豐富，呈鋪路石樣排列；但AHV-PI濃度為10 mg/L時，HUVECs的形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞體積增大，長出分枝或呈芽樣改變，胞漿出現(xiàn)顆粒樣物質(zhì)。LPS(1 mg/L)作用于HUVECs 12 h后，細(xì)胞形態(tài)明顯改變，細(xì)胞排列紊亂，胞漿出現(xiàn)顆粒樣物質(zhì)。LPS與AHV-PI混合溶液共同作用于HUVECs后，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯。表明AHV-PI可拮抗LPS引起的HUVECs損傷，對內(nèi)皮細(xì)胞具有保護作用，見圖1。

Figure 1. The effect of AHV-PI on the morphological changes of HUVECs (×200).

圖1AHV-PI對各實驗組HUVECs形態(tài)變化的影響

4 AHV-PI對HUVECs凋亡的影響

經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙染并經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測得出流式圖，左下象限為活細(xì)胞，左上象限為壞死細(xì)胞，右上象限為晚期凋亡細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞。AHV-PI(5 mg/L)組凋亡率與對照組比較無明顯變化，LPS組凋亡率明顯高于其它3組(P<0.05)，AHV-PI(5 mg/L)+LPS組凋亡率較LPS組有所下降(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The apoptotic rate in each group was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsLPS group.

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測各實驗組細(xì)胞的凋亡率

5 AHV-PI對各實驗組上清液ICAM-1、TF含量的影響

結(jié)果如表3、4所示，可看出同一時點內(nèi)，與對照組相比，LPS組上清液中ICAM-1和TF含量明顯增加(P<0.05)。與LPS組相比較，和AHV-PI(5 mg/L)+LPS組上清液ICAM-1和TF含量明顯減少(P<0.05)。且各實驗組上清液中上述細(xì)胞因子的含量隨時間延長明顯增加(P<0.05)。

表3 各實驗組細(xì)胞培養(yǎng)上清中ICAM-1含量的變化

*P<0.05vsLPS group;△P<0.05vs6 h group;#P<0.05vs12 h group.

表4 各實驗組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TF含量的變化

*P<0.05vsLPS group;△P<0.05vs6 h group;#P<0.05vs12 h group.

6 AHV-PI對各實驗組胞內(nèi)t-PA和PAI-1表達的影響

對比各組免疫組化圖片可見，LPS組胞內(nèi)黃染區(qū)域較對照組明顯減少，t-PA、PAI-1表達有所降低；與LPS組比較，AHV-PI(5 mg/L)+LPS組胞內(nèi)黃染區(qū)域增加，t-PA、PAI-1表達升高，見圖3、4。

Figure 3. The expression of t-PA in the cytoplasm of HUVECs (×200).

圖3各實驗組HUVECs胞內(nèi)t-PA表達情況

7 NF-κB p65的轉(zhuǎn)運情況

熒光顯微鏡下觀察， NF-κB的染色為紅色熒光，細(xì)胞核的DAPI染色為藍(lán)色熒光。結(jié)果如圖5所示，LPS組與對照組相比，核內(nèi)紅色熒光增強，NF-κB p65表達量增加；與LPS組比較，AHV-PI(5 mg/L)+LPS組核內(nèi)紅色熒光減弱，NF-κB p65表達減少，表明其活性受到抑制。

討 論

生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞對于維持血管系統(tǒng)內(nèi)出血-凝血的平衡發(fā)揮著重要的作用[8],一方面，其提供了完整的抗凝表面，避免血小板的黏附和聚集；另一方面，其能分泌多種血管活性分子，如NO、血管緊張素、內(nèi)皮素和前列腺素等，參與維持血管張力和器官血流量。

Figure 4. The expression of PAI-1 in the cytoplasm of HUVECs (×200).

圖4各實驗組HUVECs胞內(nèi)PAI-1的表達情況

通過形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，LPS(50 μg/L)與人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育20 h后，細(xì)胞明顯梭形化，長寬比增大，呈成纖維細(xì)胞狀[9]。當(dāng)LPS濃度增加到0.45 mg/L時，細(xì)胞收縮呈長梭形，并有較多細(xì)胞脫落[10]。內(nèi)皮細(xì)胞在凝血和纖維蛋白溶解、免疫和炎癥反應(yīng)中都起著重要的作用。一方面，血管內(nèi)皮受損其暴露出的TF和膠原分別啟動外源性凝血系統(tǒng)和內(nèi)源性凝血系統(tǒng)；另一方面，血管內(nèi)皮受損其屏障作用減弱，同時其分泌的抗凝成分減少導(dǎo)致抗凝功能紊亂，受損的血管首先通過收縮局部血管、血小板的活化形成止血栓以及凝血系統(tǒng)啟動達到止血的目的，同時啟動抗凝系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)從而達到抗凝和凝血功能的平衡。Matsumo等[11]應(yīng)用TKM-33內(nèi)皮細(xì)胞株研究發(fā)現(xiàn)，未受內(nèi)毒素處理的TKM-33細(xì)胞可產(chǎn)生或分泌大量的尿激酶型纖溶酶原激活物、少量t-PA以及PAI-1。實驗結(jié)果顯示受內(nèi)毒素處理后，HUVECs的分泌發(fā)生改變，血管內(nèi)皮釋放TF增加，血漿中TF含量增加，t-PA和PAI-1表達減少，破壞了內(nèi)皮細(xì)胞的抗凝作用，AHV-PI可以改善內(nèi)皮纖溶作用。此外，LPS可直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，使其表面黏附分子ICAM-1的表達量增加[12]，利于血小板黏附與聚集，最終促進血栓的形成。

Figure 5. The expression of NF-κB p65 in each experimental group (×200). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsLPS group. MFI: mean fluorescence intensity.

圖5各實驗組NF-κBp65的表達情況

ICAM-1是一種90 kD的免疫球蛋白樣跨膜糖蛋白，主要介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞-中性粒細(xì)胞的黏附[13]，進而損傷內(nèi)皮。NF-κB是一種廣泛存在的多效性核轉(zhuǎn)錄因子，非活化狀態(tài)NF-κB以與IκB聚合的三聚體形式或與前體蛋白聚合的二聚體形式存在于胞漿中。多種因素如LPS、細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-2)等均是NF-κB活化的刺激信號，通過不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活NF-κB誘導(dǎo)激酶或活化途徑中的其它激酶，使IκB磷酸化，再在蛋白水解酶作用下發(fā)生降解，從而使NF-κB活化而轉(zhuǎn)核發(fā)揮調(diào)控作用。NF-κB活化后能調(diào)控一系列基因的表達，如黏附分子家族的ICAM-1和p-selectin，前炎癥性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6及化學(xué)趨化因子MCP-1和IL-8等等[14]。而這些物質(zhì)都能直接或間接地作用于微血管內(nèi)皮細(xì)胞或血細(xì)胞或者介導(dǎo)它們之間的相互作用，從而導(dǎo)致微循環(huán)障礙、內(nèi)皮及組織損傷。可能存在著這樣一條通路：即LPS能誘導(dǎo)NF-κB的活化，活化的NF-κB迅速轉(zhuǎn)核與ICAM-1啟動子部位κB位點結(jié)合，啟動ICAM-1的轉(zhuǎn)錄，ICAM-1再介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞-中性粒細(xì)胞的黏附，從而導(dǎo)致血栓形成和血管內(nèi)皮損傷，這就給我們提示可以通過抑制這一條通路，如抑制 NF-κB活化或其活化后的轉(zhuǎn)核過程[15-16]作為一個治療靶點。

血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是多種血管性疾病的主要環(huán)節(jié)，保護血管內(nèi)皮功能，是防治血管性疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此，研究保護血管內(nèi)皮功能的藥物成為治療血管性疾病的重要措施[17]。研究保護內(nèi)皮細(xì)胞功能的藥物與內(nèi)皮的損傷機制密切相關(guān)，盡管目前還沒有直接保護內(nèi)皮細(xì)胞功能的藥物，但隨著人們對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機制認(rèn)識的不斷深入，將可能發(fā)現(xiàn)一批能夠有效保護內(nèi)皮細(xì)胞功能的新型藥物。

綜上所述，AHV-PI抗血小板聚集的作用機制可能與抑制細(xì)胞因子分泌及NF-κB活化轉(zhuǎn)錄有關(guān)，但AHV-PI抗血小板作用的詳細(xì)分子機制以及是否存在其它的機制還有待于更進一步的研究。