王仁俊， 周 琴， 未曉巍， 李 華， 趙永斌， 齊云峰， 欒 劍， 周曉馥

(吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)系， 吉林 四平 136000)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)作為當(dāng)代人類健康的殺手，其重要病理特征之一為交感神經(jīng)興奮性增強[1]。研究報道顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)中相關(guān)作用機制改變是導(dǎo)致心衰時交感神經(jīng)興奮性增強的重要原因之一，如CHF時下丘腦室旁核(paraventricular nucleus，PVN)內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)(如神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)等)的整合作用失衡均可導(dǎo)致交感活動亢進[2]。我們最近研究發(fā)現(xiàn)微小核苷酸[3]、前列腺素[4]和γ-氨基丁酸等的整合作用失衡亦可導(dǎo)致交感傳出活動亢進，惡化心衰。但PVN內(nèi)大麻素類物質(zhì)是否參與心衰交感神經(jīng)活動的調(diào)節(jié)過程，迄今為止，相關(guān)報道甚少。

花生四烯酰乙醇胺(arachidonylethanolamide，AEA)是內(nèi)源性大麻素樣物質(zhì)，也被稱作“內(nèi)源性香草酸物質(zhì)”，其合成途徑主要是通過磷脂酰乙醇胺與磷脂在Ca2+依賴性N-?；D(zhuǎn)移酶(N-acyltransferase)催化作用下產(chǎn)生N-arachidonoyl phosphatidylethanolamine (NArPE)，隨后又在磷脂酶D (phospholipase D，PLD)作用下最后生成AEA。已有報道顯示在心肌缺血和心律失常等疾病中AEA均發(fā)揮重要的保護作用。AEA具有擴血管降血壓的作用，但該作用在瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)基因敲減后消失；在右心房中TRPV1抑制劑能夠阻斷AEA所增強的肺迷走傳入神經(jīng)的敏感性；在急性心肌梗死后，激活TRPV1受體對心肌起保護作用[5]，還可增加平滑肌細胞內(nèi)Ca2+濃度。以上研究結(jié)果提示在外周組織中AEA與TRPV1具有保護心血管的作用，且AEA與TRPV1受體密切相關(guān)。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)AEA可誘導(dǎo)一氧化氮[6]產(chǎn)生，促進心肌舒張，且該效應(yīng)與鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II(calcium-calmodulin-dependent protein kinase II,CaMKII)密切相關(guān)[7]。另有文獻報道AEA在孤束核(nucleus tractus solitarii，NTS)中可延長壓力反射時間，抑制交感神經(jīng)活性。進一步研究發(fā)現(xiàn)AEA在麻醉大鼠PVN內(nèi)可明顯降低動脈血壓，同時在突觸處可激活TRPV1受體。也有報道指出AEA激活TRPV1受體，引起細胞內(nèi)Ca2+濃度增加[8]，從而激活CaMKII[9]。然而，當(dāng)脂肪酸酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH)水解AEA后，TRPV1的活性將受到抑制。有報道顯示CaMKII不僅能調(diào)節(jié)TRPV1的磷酸化而且能致其功能敏感化，CaMKII活性增強可使細胞內(nèi)Ca2+濃度增加，進而激活小電導(dǎo)鈣激活鉀通道(small-conduc-tance calcium-activated potassium channel， SK channel)[10]。此外，CaMKII也參與 2型SK (type 2 SK,SK2)功能的調(diào)控，當(dāng)抑制CaMKII 時，SK2對apamin的敏感性也會降低[11]。AEA也能夠通過調(diào)控胞內(nèi)Ca2+濃度來調(diào)節(jié)SK活性。另有報道稱CaMKII介導(dǎo)的磷酸化能夠調(diào)控通道的激活，在心肌細胞中KN-93(CaMKII的選擇性抑制劑)能夠阻斷SK電流的增強，SK2過表達則減弱了心衰大鼠的腎交感神經(jīng)活性[12]。綜上所述，我們提出如下假說： 心衰大鼠交感活動的亢進可能與PVN內(nèi)AEA和Ca2+濃度降低，CaMKII、SK2及磷酸化TRPV1蛋白表達下調(diào)密切相關(guān)。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

1.1實驗動物 雄性Wistar大鼠，體重180～220 g，購于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，許可證號為SCXK(吉)2011-0004。大鼠飼料購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK(吉)2010-0001。恒溫(23±2)℃，常規(guī)24 h晝夜循環(huán)。

1.2藥品試劑與實驗設(shè)備 氨基甲酸乙酯、α-氯醛糖、肝素鈉、KN-93和辣椒平(capsazepine,CPZ)購自長春鼎國生物技術(shù)有限公司。儀器設(shè)備包括腦立體定位儀(NARISHIGE，SR-5M-HT)、多通道生理信號采集系統(tǒng)(成都泰盟有限公司)、激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)(ZEISS， LSM 710)等。

2 方法與過程

2.1構(gòu)建心衰模型與假手術(shù)模型 30%氨基甲酸乙酯經(jīng)腹腔麻醉大鼠，固定于鼠板上，消毒完成后，切開頸部皮膚，分離氣管連接大鼠呼吸機，待呼吸均勻后，于3～4肋骨間開胸，暴露心臟，剪開心包膜后用0號帶線縫合針結(jié)扎心衰組動物的冠狀動脈，假手術(shù)組不結(jié)扎，手術(shù)縫合。術(shù)后3 d 每天注射1次青霉素抗感染，常規(guī)飼養(yǎng)。

2.2植入微滲透泵 將麻醉的大鼠固定于腦立體定位儀上，參照大鼠Paxions & Waston腦圖譜，于下丘腦室旁核(前囟后1.7 mm，L和R 0.5 mm，H7.2 mm)插入微滲透泵導(dǎo)管，牙科水泥固定，然后將含藥物的Alzet 1004號微滲透泵[人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,aCSF)： 0.11 μL/h； apamin： 5 μg·kg-1·h-1； AEA： 100 ng·kg-1·h-1； KN-93、CPZ和BAPTA-AM均為 10 μg·kg-1·h-1]埋于頸部皮下,另選麻醉大鼠在其腹腔植入同樣型號的微滲透泵(aCSF： 0.22 μL/h； apamin： 10 μg·kg-1·h-1； AEA： 200 ng·kg-1·h-1； KN-93、CPZ和BAPTA-AM均為20 μg·kg-1·h-1),手術(shù)縫合。常規(guī)飼養(yǎng)4周。

2.3超聲心動圖及血流動力學(xué)檢測 本研究選用冠脈結(jié)扎4周的心衰大鼠進行微滲透泵給藥，連續(xù)灌注4周后，檢測心功能、血流動力學(xué)和交感驅(qū)動指標。30%烏拉坦及α-氯醛糖腹腔注射麻醉實驗動物，采用超聲心動圖儀檢測左心室射血分數(shù)(ejection fraction，EF)、左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)和左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVDd)；分離動脈并插管，通過壓力換能器連接到多道生理記錄儀，采集平均動脈壓(mean artery blood pressure，MAP)、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)和左心室舒張末期壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)等各項指標；俯臥固定麻醉大鼠，分離腎交感神經(jīng)，通過生物神經(jīng)元放電記錄儀記錄腎交感神經(jīng)放電(renal sympathetic nerve discharge，RSND)，記錄大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖，并同步得到心率(heart rate，HR)。

2.4NG108細胞的培養(yǎng) NG108細胞為小鼠的神經(jīng)母細胞瘤和大鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤融合后形成的雜交細胞，常作為工具細胞在研究神經(jīng)系統(tǒng)與疾病發(fā)生機制過程中使用。在無菌環(huán)境中將NG108細胞接種到DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含10%胎牛血清、1% HAT、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素。分別添加5、10、15、20和25 μmol/L AEA于培養(yǎng)瓶中進行孵育實驗，5% CO2、95%過濾空氣于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。

2.5胞內(nèi)鈣離子濃度(intracellular Ca2+concentration,[Ca2+]i)的測定 DMEM培養(yǎng)基清洗細胞并用胰酶消化制備細胞懸液(終密度為1×109/L), 37℃恒溫水浴5 min后加入Fura 2-AM(終濃度為5 μmol/L)，于37 ℃恒溫搖床負載45 min, 離心后去上清(200×g， 8 min)，用平衡鹽溶液(balanced salt solution,BSS;mmol/L：NaCl 130.0，KCl 5.46，CaCl21.33，葡萄糖5.56，HEPES 20.0， 0.2%牛血清蛋白)沖洗細胞3次，BSS懸浮細胞(細胞密度保持在1×109/L)，0 ℃避光保存待測。

熒光測定方法：激發(fā)狹縫5 nm，發(fā)射狹縫10 nm，激發(fā)波長為340 nm和380 nm (2 s更換一次，交替出現(xiàn))，發(fā)射波長為480 nm，響應(yīng)因子0.02，記錄從60 s～100 s的熒光比值。按照常規(guī)公式：[Ca2+]i=Kd·(F-Fmin)/(Fmax-F)，即可求得各組細胞內(nèi)鈣離子濃度。Kd: 解離常數(shù)(224 nmol/L)； F: 不同實驗條件下的熒光強度； Fmax: 加入Triton X-100后測得的最大熒光值； Fmin: 加入EGTA后測得的最小熒光值。

2.6Western blot檢測蛋白水平 取PVN組織及NG108細胞，加入蛋白提取緩沖液(10 mmol/L Tris、1 mmol/L 蛋白酶抑制劑、1 mmol/L 磷酸酶抑制劑、1% SDS、0.1% Triton X-100和1 mmol/L PMSF)，超聲粉碎，4 ℃、12 000 r/min離心8 min；上清液即為全細胞蛋白，BCA法測蛋白濃度；SDS-PAGE分離蛋白，濾紙-膠-膜-濾紙樣的三明治法電移膜；5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜；I 抗4 ℃孵育過夜后，TBS洗滌3次,每次10 min,暗室中熒光素標記的 II 抗孵育1 h，再用TBS洗滌2次，每次min,蒸餾水洗10 min，ECL曝光，最后顯影定影，拍照。

2.7高效液相色譜法測AEA的含量 精密稱量PVN組織后，加入含水解酶抑制劑PMSF的玻璃瓶中，加入乙腈溶劑20 mL，勻漿打碎后，進行為時1 h 的超聲。4 ℃靜置過夜，棄上清。將沉淀物全部放入離心機(10 000 r/min)離心10 min，收集上層有機相。利用固相萃取技術(shù)，2 mL流動相，乙酸乙酯和丙酮(比例1∶1)共5 mL進行洗脫，收集濾液，再用氮氣吹干洗脫液。加入1 mL 乙腈復(fù)溶，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取上述樣品，精密吸取0.5 mL于離心管，加入0.5 mL AEA衍生化試劑DBD-COCl, 50 ℃恒溫反應(yīng) 2 h。100 μL去離子水終止反應(yīng)。進樣，高效液相色譜分析檢測。

2.8PVN組織Ca2+濃度的測定 用脫臼的方法處死大鼠，分開顱骨，在冰臺上用打孔法快速取出PVN組織，精密稱重后，按0.1 g∶1 mL的腦∶生理鹽水比例制備組織勻漿，設(shè)定參數(shù)4 ℃、2 500 r/min離心10 min后取上清。723型分光光度計參數(shù)設(shè)定為610 nm，光徑為1 cm，蒸餾水調(diào)零，記錄各管吸光度(A)值，計算Ca2+含量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，單因素方差分析(one-way ANOVA)用于分析心功能和血流動力學(xué)等指標，多組數(shù)據(jù)兩兩比較用Bonferroni法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心衰模型的成功建立

冠脈結(jié)扎術(shù)后 8周，檢測假手術(shù)組及心衰組大鼠各項指標，結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比，心衰組大鼠肺體比(lung/body weight, lung/BW)、心臟重量(heart weight，HW)及體重(body weight，BW)均明顯增加(P<0.05)，提示心衰大鼠有肺淤血等跡象。心衰組大鼠左心室壓力最大上升/下降速率(±dp/dtmax)及左室短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)等明顯下降；而心衰組大鼠的LVEDP顯著升高(P<0.05)；其次，較假手術(shù)組而言，心衰組大鼠心肌梗死面積(infarct size,IS)明顯增加(P<0.05)，梗死面積在32%～41%之間，而假手術(shù)組大鼠心肌未出現(xiàn)梗死的現(xiàn)象，見表1。以上結(jié)果均顯示心衰大鼠心臟功能發(fā)生顯著變化，心衰模型構(gòu)建成功。

表1CHF組與假手術(shù)組大鼠解剖學(xué)、血流動力學(xué)和交感驅(qū)動指標檢測

Table 1. The indexes of anatomy, hemodynamics and sympathe-tic drive in CHF group and sham group (Mean±SEM.n=12)

IndexShamCHF BW (g)366.0±4.5391.0±7.0 HW (g)1.38±0.031.66±0.06? RV/BW (mg/g)0.65±0.051.59±0.12? Lung/BW (mg/g)6.22±0.2714.01±0.32? IS (%)039.1±2.8? LVEDV (mL)0.31±0.100.85±0.05? LVDd (mm)6.29±0.219.81±0.33? FS (%)41.30±1.2827.80±1.38? EF (%)65.00±1.8938.00±2.13? LVSP (mmHg)122±5 100±5? LVEDP (mmHg)3.63±0.02 20.90±2.20? +dp/dtmax (mmHg/s)7 325±437 5 621±446? -dp/dtmax (mmHg/s)6 311±201 4 084±351? MAP (mmHg)99.5±3.4 91.6±3.8 HR (min-1)378.4±18.7 400.5±11.5 Basal RSND (% of maxinum)21.8±1.9 34.9±3.5? NE (ng/L)288.4±11.2 498.7±17.8?

*P<0.05vssham group.

2 PVN內(nèi)微量灌注AEA降低心衰大鼠死亡率

麻醉大鼠PVN內(nèi)微量灌注AEA和對照溶劑(vehicle，VEH)，一周后進行冠脈結(jié)扎手術(shù)，手術(shù)結(jié)束開始記錄存活率，結(jié)果顯示心肌梗死(myocardial infarction，MI)+AEA組大鼠的存活率達80%，而MI+VEH組大鼠的存活率僅64%，sham+VEH組和sham+AEA組大鼠存活率均為100%，即AEA僅增加了CHF大鼠存活率，但未對sham組大鼠存活率產(chǎn)生顯著影響，見圖1，提示PVN內(nèi)微量灌注AEA能顯著降低心衰大鼠死亡率。

Figure 1. The survival curves of CHF and sham rats at the end of the study.

圖1CHF和sham組大鼠在研究結(jié)束時的存活曲線

3 PVN內(nèi)微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin對心功能、血流動力學(xué)和解剖學(xué)指標的影響

選用結(jié)扎后4周的大鼠進行為期4周的PVN微量灌注實驗。PVN分別微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin后，進行超聲心動圖、血流動力學(xué)和解剖學(xué)等指標檢測。結(jié)果顯示AEA能夠顯著降低心衰大鼠的LVDd、LVEDV、LVEDP、Lung/BW和RV/BW，顯著提高±dp/dtmax、EF和FS，從而改善心功能。然而，KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin則分別顯著降低心功能，惡化心衰，見表2～4。

4 PVN內(nèi)微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin對交感驅(qū)動指標的影響

與溶劑對照組相比，PVN內(nèi)微量灌注AEA導(dǎo)致心衰組及假手術(shù)組的MAP、HR、RSND和血漿去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)均顯著降低(P<0.05)；PVN內(nèi)分別微量灌注KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin導(dǎo)致心衰組及假手術(shù)組的MAP、 HR、 RSND和NE均顯著增強(P<0.05)，但假手術(shù)組較心衰組反應(yīng)更為明顯，見圖2。這些結(jié)果提示PVN內(nèi)CaMKII/TRPV1/Ca2+/SK2信號通路可能參與了AEA對心衰大鼠交感神經(jīng)活動的抑制作用。

5 皮下微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin對交感驅(qū)動指標的影響

與溶劑對照組相比，分別在假手術(shù)組和CHF組大鼠皮下微量灌注2倍于PVN內(nèi)微量灌注劑量的AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin對MAP、HR、RSNA和NE均無明顯影響(數(shù)據(jù)未在文中顯示)。這些結(jié)果提示AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin分別對交感驅(qū)動指標的影響是由下丘腦室旁核介導(dǎo)，而非藥物擴散至外周組織產(chǎn)生的效應(yīng)。

表2PVN內(nèi)微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin對心功能指標的影響

Table 2. The effects of PVN microinfusion of AEA, KN-93, CPZ, BAPTA-AM and apamin on cardiac function indexes (Mean±SEM.n=6)

TreatmentLVDd (mm)ShamCHFLVEDV (mL)ShamCHFEF (%)Sham CHFFS (%) Sham CHFaCSF6.27±0.309.78±0.21?0.34±0.070.87±0.05?83.50±2.0150.70±1.98?41.70±1.0227.50±1.23?AEA3.97±0.23?8.92±0.37??0.22±0.05?0.77±0.03??97.20±1.98?61.10±1.74??64.90±0.97?41.20±1.28??KN-938.74±0.14?11.25±0.18??0.56±0.10?0.99±0.03??61.70±1.95?40.50±2.01??30.20±0.89?21.60±0.78??CPZ8.69±0.12?11.80±0.20??0.59±0.08?1.01±0.02??60.90±2.03?41.10±1.85??30.90±1.01?20.90±0.74??BAPTA-AM8.61±0.14?11.30±0.17??0.60±0.06?1.06±0.08??61.20±1.78?40.80±1.54??31.20±1.12?20.70±0.76??Apamin8.89±0.21?11.70±0.24??0.58±0.02?1.02±0.09??62.30±2.11?41.20±1.36??31.80±1.28?21.30±0.71??

*P<0.05vssham+aCSF group;?P<0.05vsCHF+aCSF group.

表3PVN內(nèi)微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin對血流動力學(xué)指標的影響

Table 3. The effects of PVN microinfusion of AEA, KN-93, CPZ, BAPTA-AM and apamin on haemodynamic indexes (Mean±SEM.n=6)

TreatmentLVSP (mmHg)ShamCHFLVEDP (mmHg)ShamCHF+dp/dtmax (mmHg/s)ShamCHF-dp/dtmax (mmHg/s) Sham CHFaCSF120±3 100±4? 3.29±0.03 21.20±1.98 7 790±201 5 621±187? 6 301±207 4 124±310?AEA141±2?113±5?? 2.01±0.04?20.30±1.32??8 145±124?5 949±162??7 991±198?5 721±223??KN-93102±3?91±2??6.61±0.04?24.10±1.34??5 438±198?3 318±132??5 012±211?3 025±196??CPZ101±4?90±3??6.54±0.05?23.10±1.28??5 325±201?3 321±146??5 106±209?3 054±203??BAPTA-AM102±5?91±4??6.23±0.02?23.80±1.19??5 384±189?3 315±139??5 099±196?3 009±301??Apamin100±2?89±6??6.79±0.04?22.90±1.09??5 345±179?3 319±201??5 014±184?3 015±297??

*P<0.05vssham+aCSF group;?P<0.05vsCHF+aCSF group.

表4PVN內(nèi)微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin對心臟解剖學(xué)指標的影響

Table 4. The effects of PVN microinfusion of AEA, KN-93, CPZ, BAPTA-AM and apamin on anatomical indexes (Mean±SEM.n=6)

TreatmentHW (g)RV/BW (mg/g)Lung/BW (mg/g)ShamCHFShamCHFShamCHFaCSF1.37±0.041.68±0.03?0.66±0.051.61±0.08?6.21±0.2714.07±0.31?AEA1.21±0.07?1.55±0.02??0.39±0.03?1.48±0.04??5.02±0.21?12.96±0.29??KN-931.98±0.03?1.86±0.04??0.97±0.02?1.79±0.10??8.74±0.21?15.85±0.22??CPZ1.96±0.04?1.90±0.02??0.98±0.01?1.81±0.14??8.71±0.13?15.75±0.34??BAPTA-AM1.99±0.07?1.91±0.03??0.97±0.03?1.89±0.13??8.80±0.15?15.80±0.37??Apamin2.01±0.06?1.93±0.02??0.98±0.09?1.90±0.14??8.83±0.20?15.81±0.28??

*P<0.05vssham+aCSF group;?P<0.05vsCHF+aCSF group.

6 心衰大鼠PVN內(nèi)AEA含量、Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平的檢測

冠脈結(jié)扎8周后，檢測大鼠PVN內(nèi)AEA含量、Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，心衰組大鼠PVN內(nèi)AEA含量、Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，見圖3。這些結(jié)果提示PVN內(nèi)AEA含量、Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平降低可能與心衰發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

Figure 2. The effects of microperfusion of AEA, KN-93, CPZ, BAPTA-AM and apamin in PVN on the sympathetic drive indexes. A: original tracings of artery blood pressure (ABP) and renal sympathetic nerve discharge (RSND); B: heart rate (HR); C: mean arterial pressure (MAP); D: RSND; E: plasma norepinephrine (NE). Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham+VEH group;?P<0.05vsCHF+VEH group.

圖2PVN內(nèi)微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin對交感驅(qū)動指標的影響

7 AEA孵育NG108細胞后細胞內(nèi)Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平的檢測

離體培養(yǎng)NG108細胞，分別用5、10、15、20和25 μmol/L的AEA孵育NG108細胞24 h后，與正常組相比，AEA孵育可劑量依賴性增加NG108細胞內(nèi)Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平(P<0.05)，見圖4、5。這一結(jié)果提示CaMKII/TRPV1/Ca2+信號通路可能介導(dǎo)了AEA對NG108細胞內(nèi)SK2通道蛋白表達的抑制作用。

討 論

本研究運用神經(jīng)核團微量灌注、神經(jīng)電生理、細胞培養(yǎng)及Western blot等技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)在心衰大鼠PVN內(nèi)AEA含量、Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平均顯著減少，PVN內(nèi)微量灌注AEA能顯著降低交感驅(qū)動指標(包括HR、MAP、RSND和NE)；然而，分別微量灌注KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin能顯著增強交感驅(qū)動指標。

Figure 3. AEA content (A), intracellular Ca2+concentration ([Ca2+]i; B), and CaMKII (C), SK2(D) and phosphorylated TRPV1 (E) protein levels in PVN of the rats with CHF. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham group.

圖3大鼠PVN內(nèi)AEA含量、胞內(nèi)Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平的比較

Figure 4. The effect of AEA on intracellular Ca2+concentration ([Ca2+]i) in NG108 cells. A: representative confocal images showing the changes of [Ca2+]i; B: the quantitative analysis of [Ca2+]i. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖4AEA孵育NG108細胞對胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

在離體實驗部分，AEA孵育可劑量依賴性增加NG-108細胞內(nèi)Ca2+濃度及CaMKII、SK2和磷酸化TRPV1蛋白水平。以上結(jié)果提示室旁核內(nèi)CaMKII/TRPV1/Ca2+/SK2信號通路可能介導(dǎo)了AEA對心衰大鼠交感神經(jīng)活動的影響。

本研究對AEA、CaMKII選擇性抑制劑KN-93、TRPV1通道特異性阻斷劑CPZ、Ca2+螯合劑BAPTA-AM和SK通道阻斷劑apamin的溶劑都進行了心衰及假手術(shù)大鼠PVN注射，記錄了各種溶劑對交感驅(qū)動指標的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各種溶劑對交感驅(qū)動指標均無顯著影響，因此，本文展示的數(shù)據(jù)中選取aCSF組作為溶劑對照組。在離體實驗部分，本研究采用AEA孵育NG108細胞后，發(fā)現(xiàn)AEA誘導(dǎo)了磷酸化TRPV1蛋白水平的增加，同時也增加了CaMKII和SK2蛋白表達量，提示CaMKII活性增強可能誘導(dǎo)了TRPV1磷酸化，進而激活SK2，這一結(jié)果與Liu等[13]的報道相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)分別微量灌注AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin時，雖然心衰組及假手術(shù)組交感驅(qū)動指標均發(fā)生顯著變化，但假手術(shù)組反應(yīng)更為明顯。這可能與心衰大鼠減壓反射發(fā)生鈍化有關(guān)；另外，心衰大鼠PVN內(nèi)的CaMKII/TRPV1/Ca2+/SK2信號通路功能鈍化也可能是導(dǎo)致心衰大鼠交感驅(qū)動指標對AEA、KN-93、CPZ、BAPTA-AM和apamin的敏感性降低的主要原因之一。

Figure 5. The results of Western blot showed the effects of AEA on the protein levels of CaMKII, SK2, TRPV1 and phosphorylated TRPV1 in the NG108 cells. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol (without treatment) group.

圖5AEA孵育NG108細胞后對CaMKII、SK2及磷酸化的TRPV1蛋白水平的影響

與本研究結(jié)果相矛盾的是，另一課題組的研究顯示AEA注入兔腦室可導(dǎo)致交感神經(jīng)活動亢進[14]，但該課題組采用的給藥方式是腦室注射，因腦室注射法無法定位到具體的神經(jīng)核團，所以不能確定AEA具體是通過哪個神經(jīng)核團發(fā)揮作用；此外，雖然兔與鼠都屬于小型哺乳動物，但因二者基因差異較大，所以很可能是因遺傳背景不同導(dǎo)致交感神經(jīng)活動對AEA的反應(yīng)不一致，但確切機制仍有待進一步深入研究。另有研究報道長期使用低劑量辣椒素激活TRPV1后，交感神經(jīng)興奮性未發(fā)生顯著改變，其原因可能與長期辣椒素刺激引起生物耐受性有關(guān)。值得注意的是，有報道顯示抑制CaMKII對阿爾茨海默癥大鼠有神經(jīng)保護作用[15]，但在心衰模型與阿爾茨海默癥發(fā)病機制不同，藥物作用核團亦不相同，所以在CHF大鼠PVN內(nèi)CaMKII發(fā)揮作用如何，有待進一步研究。陳佳等[16]曾指出心衰患者血漿中AEA含量有所升高，然而，本研究發(fā)現(xiàn)心衰大鼠PVN內(nèi)AEA含量顯著降低，其中矛盾的原因很可能與我們在研究中采用的心衰動物模型與陳佳等在臨床研究中心衰患者的疾病嚴重程度不完全一致有關(guān)；此外，也可能與中樞PVN內(nèi)AEA與外周血漿中的AEA在心血管系統(tǒng)中調(diào)控機制存在差異有關(guān)。但在心衰狀態(tài)下中樞和外周AEA參與心血管活動調(diào)節(jié)的確切機制如何仍有待進一步深入研究。有趣的是，也有研究顯示CaMKII可調(diào)節(jié)TRPV1受體通道蛋白的磷酸化水平，AEA進入細胞后可激活TRPV1受體，引起細胞內(nèi)Ca2+濃度增加；鈣內(nèi)流增加及CaMKII介導(dǎo)的磷酸化作用均能介導(dǎo)SK信號通路激活，且在NTS中微量注射AEA能夠延長壓力反射時間，抑制交感神經(jīng)活性；PVN內(nèi)注射AEA可明顯降低動脈血壓等，這部分研究結(jié)論均與本研究中AEA介導(dǎo)TRPV1磷酸化從而抑制交感神經(jīng)興奮性的結(jié)果相一致。

當(dāng)然，本研究中也存在著許多的不足之處，我們將其歸納為以下幾點：(1)本研究雖然證實在心衰大鼠PVN內(nèi)AEA能抑制交感神經(jīng)興奮，但是否有其它因子輔助AEA對交感神經(jīng)興奮性產(chǎn)生影響，目前仍無法排除；(2)本研究中雖然證實AEA對心衰大鼠交感神經(jīng)興奮性產(chǎn)生影響與SK信號通路密切相關(guān)，但SK通道存在4種亞型(即SK1～SK4)，這些通道亞型是否分別或共同參與調(diào)控交感神經(jīng)興奮，在本研究中未進行分類探究，需要進一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果提示在心衰狀態(tài)下，PVN內(nèi)AEA含量降低，進而抑制了CaMKII/TRPV1/Ca2+/SK信號通路，最終導(dǎo)致交感神經(jīng)興奮亢進。本研究所證實的心衰狀態(tài)下PVN內(nèi)CaMKII/TRPV1/Ca2+/SK信號通路介導(dǎo)AEA對心衰大鼠交感神經(jīng)激活產(chǎn)生抑制作用，雖不能直接應(yīng)用于臨床，但本研究所驗證的假說可為心衰治療提供實驗室理論依據(jù)，為心衰疾病的治療提供新的靶點。