邱志利 蔣曉平 袁小東 譚嘉萌

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%，40%的患者確診時已經(jīng)屬于Ⅲ～Ⅳ期[1]。目前，對于喉癌的治療已拓展為手術(shù)切除聯(lián)合放化療的綜合性治療方案。盡管如此，喉癌尤其是晚期喉癌的治療效果依然不盡如人意：治療后發(fā)音效果差，吞咽功能受影響，以及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、對放化療不敏感等問題。因此，進一步探索喉癌的預(yù)防和診治方法(包括治療靶點探索)具有重要的理論和現(xiàn)實意義，也是擺在每一位醫(yī)務(wù)工作者和科研人員面前的一個重要而迫切的課題。

NFBD1(nuclear factor with BRCT domain 1),也稱MDC1(mediator of DNA damage checkpoint protein 1)，是一個參與細胞內(nèi)DNA損傷后細胞應(yīng)答的重要分子[2]。NFBD1基因最早由日本的Kazusa DNA研究所在超長cDNA庫大規(guī)?？寺y序中發(fā)現(xiàn)，編號為KIAA0170,cDNA全長約為6 940 bp[3]。NFBD1蛋白由2 089個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量高達227×103，包含1個位于氨基端的FHA(forkhead homology-associated)結(jié)構(gòu)域、2個位于羧基端的BRCT(BRCA1 C-terminal motifs)結(jié)構(gòu)域和中間的多個重復(fù)P/ST結(jié)構(gòu)域，隸屬于BRCT蛋白超家族[4]。NFBD1作為DNA損傷與應(yīng)答研究領(lǐng)域的一個新的熱點分子，得到國外多個研究小組的關(guān)注，成為國際上一個新的研究熱點，但仍處于起始階段。有研究[5-6]表明，小干擾RNA抑制NFBD1基因后，鼻咽癌細胞對化療藥物順鉑的敏感度及放療的敏感度顯著提高。我們率先通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)NFBD1基因在喉癌細胞系Hep-2中的表達，觀察其對Hep-2細胞放療、化療后凋亡率、周期阻滯及存活率的影響，探討抑制NFBD1基因表達對喉癌細胞系Hep-2放化療敏感度的影響，為尋覓新的治療靶點找到理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 本課題所用喉癌細胞系Hep-2購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞庫，采用含10% 胎牛血清的1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 試劑 1640 培養(yǎng)基及胎牛血清購自Hyclone公司，NFBD1siRNA、control siRNA 均購自上海吉凱公司。針對NFBD1基因siRNA特異序列NFBD1-siRNA：5′-GAGGCAGACUG-UGGAUAAATT-3′；無意義序列control siRNA：TTCTCCGAACGTGTCACGT。RNA提取試劑盒及實時定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(quantitative real time polymerase chain reaction,QRT-PCR)試劑盒購自Takra公司，NFBD1一抗購自Abcam公司，actin抗體及HRP二抗購自Cell Signaling公司，PVDF膜購自Millipore公司，MTS一步法細胞活力檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定篩選 喉癌細胞系Hep-2培養(yǎng)于含10%胎牛血清的Hyclone 1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，常規(guī)接種于96孔板，每孔密度2×104細胞。細胞融合率為50%左右時，按感染復(fù)數(shù)(MOI=10)將慢病毒液加入培養(yǎng)液中，24 h后換正常培養(yǎng)基，72 h后加入嘌呤霉素(1 μg/mL)。采用無限稀釋法篩選陽性克隆，然后再擴大培養(yǎng)，得到穩(wěn)定表達NFBD1 siRNA的細胞株(NFBD1 siRNA組，實驗組)和陰性對照細胞株(control siRNA組，對照組)。

1.2.2 QRT-PCR檢測NFBD1 mRNA表達 TRIZOL提取NFBD1 siRNA和control siRNA細胞的總mRNA(按說明書步驟進行)，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行目的序列及內(nèi)參β-actin的QRT-PCR擴增。用于QRT-PCR的試劑為Takara公司的SYBR Premix Ex Taq 試劑盒(熒光為SYBR Green 1)，PCR 儀為iCycler iQ 實時PCR 檢測系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司)，NFBD1引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，β-actin的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。參照PCR試劑盒使用說明書進行。GAPDH 和NFBD1 的上下游引物序列見表1。

表1 QRT-PCR所用引物序列

1.2.3 Western 印跡技術(shù)檢測NFBD1蛋白的表達 細胞裂解液裂解control siRNA和NFBD1 siRNA細胞，加入SDS 上樣緩沖液(62.5 mmol/L，Tril-HCl，pH=8.0，2%β-巰基乙醇，0.01% 溴酚藍) 于100 ℃ 加熱變性處理5 min。6%SDS-PAGE 分離樣品中的蛋白質(zhì)。用封阻液(含5%牛奶的TBST) 將轉(zhuǎn)印后的蛋白膜于室溫封阻2 h。用TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入適量稀釋后的一抗，4 ℃避光過夜；TBST洗膜3次，每次5 min；加入1∶5 000稀釋的耦聯(lián)辣根過氧化物酶二抗，室溫1 h，TBST 洗膜3 次。將結(jié)果采用化學(xué)發(fā)光法進行檢測。

1.2.4 細胞周期檢測 指數(shù)生長期細胞經(jīng)0 Gy假照射和4 Gy照射后48 h收集，收集細胞加入70%冰乙醇中4 ℃過夜，磷鹽酸緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌2遍后，避光加入含有50 μg/mL的RNA酶和50 μL/mL PI的染色液中，室溫染色30 min后，流式細胞儀檢測細胞周期各時相所占百分比。

1.2.5 細胞凋亡率檢測 采用碧云天公司Annexin-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。指數(shù)生長期細胞經(jīng)0 Gy假照射和4 Gy照射后48 h收集，用PBS洗滌，離心，收集10×104個細胞，再加入結(jié)合緩沖液，Annexin V-FITC，PI 混勻。由FACS Calibur 流式細胞儀檢測(Ex=488 nm；Em=530 nm)細胞凋亡的情況(綠色熒光通過FITC 通道FL1 檢測，紅色熒光通過PI通道FL2檢測)。

1.2.6 放療后細胞存活率分析 采用Promega公司的MTS一步法細胞活力檢測試劑盒，具體參照試劑盒說明書。將各組生長良好的細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中(只加培養(yǎng)液孔設(shè)為空白對照)，待細胞貼壁適應(yīng)環(huán)境后，給予0、4、8 Gy照射48 h后，每孔加入MTS試劑10 μL，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，然后用酶標儀測定波長490 nm處的吸光度值，計算活細胞率。

1.2.7 化療后細胞成活率分析 將細胞分為control siRNA+CDDP組、NFBD1 siRNA+CDDP組，采用MTT方法，具體參照試劑盒說明書。將各組生長良好的細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中(只加血清孔設(shè)為空白對照組)，待細胞貼壁適應(yīng)環(huán)境后，給予順鉑處理48 h后，每孔加入MTT試劑(0.5 μmol/L)20 μL，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～4 h；然后用酶標儀測定波長490 nm處的吸光度值，重復(fù)3次，計算細胞成活率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料采用單因素方差分析方法，計數(shù)資料采用卡方檢驗，組間比較采用SNK-q 檢驗，P<0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA對喉癌Hep-2細胞NFBD1 mRNA水平的抑制效果 如圖1所示，QRT-PCR結(jié)果顯示，實驗組的mRNA表達水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明構(gòu)建的NFBD1 siRNA特異性干擾序列慢病毒載體能有效抑制喉癌Hep-2細胞NFBD1基因的表達。

2.2 siRNA對喉癌Hep-2細胞 NFBD1 蛋白表達水平的抑制效果 如圖2所示，實驗組的蛋白表達水平明顯低于對照組(P<0.05)，表明構(gòu)建的NFBD1 siRNA特異性干擾序列慢病毒載體能有效抑制喉癌Hep-2細胞NFBD1基因的蛋白表達。

2.3 TUNEL熒光染色法檢測抑制NFBD1表達對喉癌細胞凋亡的影響 細胞經(jīng)TUNEL染色后，在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細胞會發(fā)出綠色熒光，而未發(fā)生凋亡的細胞不會帶熒光。如圖3所示，實驗組中呈綠色熒光的凋亡細胞明顯多于對照組(P<0.05)。再次證明抑制NFBD1的表達可以促進喉癌細胞Hep-2的凋亡。

圖1. siRNA轉(zhuǎn)染后NFBD1 mRNA表達水平

圖2. siRNA轉(zhuǎn)染后 NFBD1 蛋白表達水平

圖3. TUNEL熒光染色實驗(×100 ) A.對照組; B.實驗組

2.4 抑制NFBD1表達對喉癌Hep-2細胞放療后凋亡率的影響 如圖4、5所示，喉癌Hep-2細胞經(jīng)4 Gy照射后，凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)明顯增加，實驗組增加了17.92%，對照組增加了7.47%(P<0.05)，表明放療增加喉癌Hep-2細胞的凋亡率，且抑制NFBD1基因的表達能促進喉癌Hep-2細胞的凋亡率，同時提高細胞對放射線的敏感度。

圖4. 流式細胞儀檢測2組細胞照射前、后細胞凋亡的變化

2.5 抑制NFBD1表達對喉癌Hep-2細胞放療后周期的影響 如圖6、7所示，喉癌Hep-2細胞經(jīng)4 Gy照射后，G2/M期細胞比例明顯增加，實驗組增加了35.58%，對照組增加了18.70%(P<0.05)，表明放療可引起喉癌Hep-2細胞的G2/M期阻滯，且抑制NFBD1基因的表達能促進喉癌Hep-2細胞放療后的G2/M期阻滯。

圖5. 定量分析2組細胞照射前、后凋亡的變化

圖6. 流式細胞儀檢測2組細胞照射前、后細胞周期的變化

圖7. 定量分析2組細胞照射前、后細胞周期變化

2.6 抑制NFBD1表達對喉癌Hep-2細胞放療后細胞存活率的影響 如表2及圖8所示，隨著照射劑量的增加，各組細胞存活率均明顯下降，且實驗組較對照組細胞下降更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.7 抑制NFBD1表達后對Hep2細胞化療敏感度的影響NFBD1 siRNA 轉(zhuǎn)染 24 h，給予順鉑處理 48 h 后分析各組細胞存活率。與對照組(97.0%±1.6%)，實驗組(92.6%±2.1%)，control siRNA+CDDP 組(63.2%±2.1%)相比，Hep2細胞株中NFBD1 siRNA+CDDP 組細胞存活率(37.2%±1.7%)最低(P<0.05)，表明 siRNA 介導(dǎo)的NFBD1 表達抑制能顯著增強Hep2細胞對化療藥物的敏感度。

表2 MTT法檢測2組細胞放療前、后細胞存活率的影響

圖8. 2組細胞在0、4、8 Gy照射后48 h的細胞存活百分數(shù)，0 Gy組的細胞存活率為100%

3 討論

喉癌是耳鼻咽喉科常見惡性腫瘤之一 ,發(fā)病率高,嚴重影響人們的生活質(zhì)量。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個涉及多重因素改變的復(fù)雜過程 ,細胞周期紊亂是其主要發(fā)病機制之一, 是由于細胞周期失調(diào)后導(dǎo)致的細胞無限制增殖[7]。喉癌初期癥狀隱匿，常被忽視，待到發(fā)現(xiàn)并確診時多已進入終末期，錯過了最佳治療時間。放療作為喉鱗狀細胞癌及其他頸部鱗狀細胞癌的主要治療手段，往往存在放療不敏感、放療抵抗以及放療后易復(fù)發(fā)等治療障礙，因此，增強喉癌放療敏感度，降低放療抵抗就成為廣大學(xué)者爭相追逐的研究熱點之一?；蛑委熓峭ㄟ^基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，用正常基因原位置換缺陷基因，對單基因病進行治療。隨著喉癌相關(guān)基因研究不斷深入，基因治療喉癌已經(jīng)成功地從實驗室走向臨床[8]。

NFBD1是一個參與DNA損傷后細胞應(yīng)答通路的重要分子[9]。關(guān)于NFBD1的研究是國際生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一個非?；钴S的熱點。目前研究主要集中于NFBD1在DNA雙鏈損傷應(yīng)答通路中的分子功能等基礎(chǔ)理論研究[10]，但對于NFBD1和腫瘤的關(guān)系以及以NFBD1為靶點的分子治療應(yīng)用研究才剛剛起步。研究表明，外源轉(zhuǎn)染NFBD1使之過表達，可使細胞更好地抵御DNA雙鏈損傷；而通過siRNA抑制NFBD1的表達，則導(dǎo)致細胞對DNA損傷放射線更加敏感，并出現(xiàn)細胞周期檢測點缺陷和細胞凋亡增加[11]。Lou等進而成功建立了NFBD1基因敲除動物模型，通過體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)NFBD1基因敲除鼠具有生長抑制、雄性不孕、免疫缺陷、染色體不穩(wěn)定、DNA修復(fù)缺陷、放療增敏[12]等特性。這些研究表明NFBD1是一個有效用于鼻咽癌靶向治療的新分子靶點，為將NFBD1 siRNA用于臨床喉癌的治療奠定了良好的基礎(chǔ)。

目前，喉癌的治療主要采取以手術(shù)為主，聯(lián)合放化療的綜合治療，均有較大破壞性及不良反應(yīng)。尤其是對于喉癌放化療增敏劑的研究甚少。本課題組以NFBD1為切入點，探討NFBD1在喉癌放化療敏感度中的作用和地位，結(jié)果表明，下調(diào)NFBD1表達后，喉癌細胞的放化療敏感度顯著提高。

NFBD1下調(diào)后喉癌細胞放療敏感度提高的可能原因包括：①NFBD1下調(diào)致細胞周期檢測點缺陷，機體不能識別及修復(fù)DNA損傷的細胞[13-14]；②NFBD1下調(diào)后，DNA損傷信號不能被擴大并傳導(dǎo)出去， DNA損傷修復(fù)蛋白不能聚集于DNA損傷位點，細胞凋亡增加[15-17]；③腫瘤細胞放療敏感度提高也源于DNA損傷的疊加效應(yīng)[18]，抑制NFBD1表達后，可降低DNA 損傷的修復(fù)能力[19]。

NFBD1表達下調(diào)后，Hep-2細胞化療敏感度提高，其可能原因包括:①NFBD1表達下調(diào)后，促使細胞周期停留于 M 期，從而提高其化療敏感度，因為處于 M 期的細胞對化療敏感度最高；②細胞凋亡增加。Nakanishi 等[20]研究表明，DNA損傷后，NFBD1通過與p53相互作用而調(diào)節(jié)細胞凋亡。NFBD1作為DNA損傷應(yīng)答系統(tǒng)的一個新成員，其相關(guān)功能研究正成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點。目前研究發(fā)現(xiàn)：在DNA損傷后NFBD1發(fā)生磷酸化,并和DNA損傷應(yīng)答通路中的多個蛋白相互作用，從而介導(dǎo)DNA損傷修復(fù)或者促進細胞發(fā)生凋亡。具體的機制可以概括為:在DNA損傷初期,NFBD1表達增加,與p53結(jié)合,抑制p53磷酸化，從而抑制p53促凋亡的作用并同時啟動NFBD1介導(dǎo)的DNA修復(fù)機制,細胞DNA得以修復(fù)，從而使細胞盡量存活下來。如果損傷難以修復(fù),NFBD1表達就會下降,p53與NFBD1分離,從而發(fā)揮p53促凋亡的作用。所以NFBD1是p53介導(dǎo)的與凋亡密切相關(guān)的重要分子。

后續(xù)實驗，我們將進一步闡明NFBD1下調(diào)增加放化療敏感度的分子基礎(chǔ)，以及檢測NFBD1在喉癌組織中的表達情況及臨床相關(guān)性，并通過裸鼠體內(nèi)實驗進一步證實本實驗的結(jié)論。

本實驗研究表明，通過慢病毒包裝的siRNA干擾技術(shù)能有效抑制NFBD1的表達，并顯著提高喉癌細胞系Hep-2對放化療的敏感度，其機制可能為NFBD1表達抑制后導(dǎo)致細胞周期檢測點缺陷及DNA損傷修復(fù)能力降低而產(chǎn)生的放療增敏效應(yīng)。這為下一步開展以NFBD1為靶基因，提高腫瘤細胞放化療敏感度，從而將基因治療與放療相結(jié)合的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。