王雪皎　郭彥斌　李紫薇　鄭冉冉　吳紅芝

摘 要 為篩選抗軟腐病品種，調(diào)整云南彩色馬蹄蓮品種結(jié)構(gòu)，對云南不同地區(qū)收集到的4個軟腐病病原菌進行致病力測定，篩選出強致病力菌株p3，并通過形態(tài)學和16S rDNA分子鑒定為胡蘿卜果膠軟腐桿菌（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum）。將p3菌株接種于具4～5葉片的不同品種彩色馬蹄蓮上，記錄病情指數(shù)。結(jié)果表明：測試的彩色馬蹄蓮品種均為感病品種，但不同品種間抗性存在差異，其中栽培品種ym063、ym044、ym068的抗性較好，其次為ym048，ym008、ym011。

關(guān)鍵詞 彩色馬蹄蓮 ；細菌性軟腐病 ；病原鑒定 ；抗性鑒定

中圖分類號 S436.8 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.06.015

Resistance Identification of Zantedeschia hybrida Cultivars Against the Soft Rot

WANG Xuejiao GUO Yanbing LI Ziwei ZHENG Ranran WU Hongzhi

（Yunnan Agriculture University， Kunming， Yunnan 650201）

Abstract In order to screen the resistant cultivars to soft rot and adjust the variety structure of Zantedeschia hybrida Spr. in Yunnan， four strains of soft rot bacteria were collected in different areas of Yunnan， and their pathogenicity determined. One strain p3 out of the four was screened to have a high pathogenicity and identified as Pectobacter carotovora subsp. carotovora Pcca through morphological observation and 16 SrDNA molecular identification. The strain p3 was then inoculated onto different cultivars of Zantedeschia hybrida Spr. having 3～4 leaves， and the disease index was recorded. The results showed that all the cultivars tested were susceptible to the bacterial soft rot but were different in resistance against the bacterial soft rot among different cultivars， of which cultivars YM063， YM044 and YM068 showed higher resistance to soft rot， followed by cultivars YM048， YM008 and YM011.

Keywords Zantedeschia hybrida ； bacterial soft rot ； pathogen identification ； resistant identification

彩色馬蹄蓮（Zantedeschia hybrida Spr.）又稱彩色海芋。原產(chǎn)于南非，為天南星科（Araceae）馬蹄蓮屬（Zantedeschia）多年生草本球根花卉[1-2]。彩色馬蹄蓮具有形態(tài)高雅、色彩艷麗、花葉俱賞等特征，應(yīng)用范圍非常廣泛。除可作優(yōu)良切花、盆花外，還是花束、花籃、花壇、花境等的重要花材。自20世紀90年代來，受到國內(nèi)外消費者的大力追捧，已成為世界性新興高檔花卉。然而因軟腐病，彩色馬蹄蓮的發(fā)展卻受到了極大的限制[3-4]。據(jù)報道，彩色馬蹄蓮軟腐病的致病病原菌為果膠軟腐桿菌（Pectobacterium carotovorum carotovorum，PCC）。該病菌廣泛分布于溫帶和熱帶地區(qū)，寄主范圍廣泛，大多寄生在植物的細胞腔、氣孔、傷口處，少數(shù)寄生在微管組織中，常使被侵染器官薄壁組織發(fā)生浸漬腐爛，最終導致整個植株死亡。Pcc可以潛伏侵染，一旦遇高溫、高濕、傷口、土壤通氣不良等適宜條件，極易引發(fā)病害。雖已有了不少生物、化學等方法防治彩色馬蹄蓮細菌性軟腐病，但防治效果均不理想。目前，應(yīng)用最多的主要是靠嚴格的衛(wèi)生管理或使用滅菌泥炭等消毒基質(zhì)[5-10]。

關(guān)于彩色馬蹄蓮軟腐病的研究大多集中在病原菌的分離與鑒定[11]、生物學特性、病害的癥狀識別與綜合防治方面[12-13]，品種抗性方面研究尚少。云南獨特的地理環(huán)境和較大的日溫差，有利于促進植物養(yǎng)份的積累，為彩色馬蹄蓮等球根花卉種球生產(chǎn)提供了得天獨厚的自然條件，是我國重要的彩色馬蹄蓮產(chǎn)業(yè)基地[14]。品種結(jié)構(gòu)合理布局是云南彩色馬蹄蓮產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展和花農(nóng)獲得經(jīng)濟效益的保證，然而尚未見云南栽培品種抗性鑒定和使用抗病品種控制病害的研究報道。本研究對云南不同地區(qū)病株進行了病原菌的分離、分子鑒定、致病性鑒定、及不同品種彩色馬蹄蓮的抗性鑒定，旨在為今后栽培管理提供理論和實際參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

所用供試品種組培苗ym008，ym011，ym044，ym063，ym068，ym048，由云南農(nóng)業(yè)大學實驗組收集保存的種球采用組織培養(yǎng)的方法統(tǒng)一建立無菌體系獲得。

分別從熱區(qū)（玉溪楊武）、溫帶（昆明大板橋）、寒涼區(qū)（尋甸）等不同氣候型區(qū)域采集彩色馬蹄蓮軟腐病植株，作為病原菌分離鑒定的來源材料。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化

采用稀釋涂布平板法和平板劃線分離法，分別切取彩色馬蹄蓮植株莖或葉病健交界處組織，切成小塊，用75%的酒精表面消毒30 s，無菌水洗3次，5% NaCl表面消毒1 min，無菌水洗3次，研磨碎，加入少量無菌水，振蕩靜置5 min后將病健組織研磨液等梯度稀釋至10-6，用稀釋涂布平板法將不同稀釋度溶液涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基，放置28℃培養(yǎng)箱中，24 h后觀察菌落形態(tài)。挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上劃線，純化培養(yǎng)24 h，純化3次后于-80℃保存菌株。

1.2.2 最適培養(yǎng)基的篩選

將菌株活化后用無菌水等梯度稀釋至10-6，取10-4，10-5，10-6三個稀釋度的菌懸液各200 μL，分別涂布于TSA、PDA、LB、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，每濃度3個平板，放置20～30 min后，再將平板倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察病原菌在不同稀釋度、不同培養(yǎng)基條件下菌落數(shù)量分布，根據(jù)平板上菌落的穩(wěn)定性和數(shù)量確定適宜的培養(yǎng)基種類。選取適宜稀釋度培養(yǎng)基（每皿30～300個菌落）計數(shù)菌落。

1.2.3 菌株的鑒定

采用簡單染色法、Gram染色法在油鏡下觀察菌體形態(tài)，對形態(tài)上初步判斷為Pcc的病原菌，采用PCR進行進一步鑒定。

采用DNA提取試劑盒（Promega）提取細菌基因組DNA，用細菌16S通用引物PF：5′-GAAGTCGTAACAAGG-3′和PR：5′-CAAGGCATCCACCGT-3′進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR緩沖液（含Mg2+）2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP1 μL、5U/μL TaqDNA酶0.2 μL、5 mmol/L正反向引物各1 μL、DNA模板1 μL，雙蒸水補足至25 μL。PCR擴增程序為：94℃ 2 min；94℃ 45 s，57℃ 45 s，72℃ 2 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物純化后，由昆明碩擎生物科技有限公司雙向測序，引物分別為PF和PR，將測得的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫的序列進行同源性分析。

1.2.4 回接試驗

選取相同或相近繼代培養(yǎng)代數(shù)的彩色馬蹄蓮的組織培養(yǎng)苗進行移栽，當組培苗移栽成活具4～5葉片時，將菌株接種于彩色馬蹄蓮上。保存的菌種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中活化，28℃培養(yǎng)24 h，用無菌水配成濃度為1×108 CFU/ml（colony-forming unitsperml，每毫升繁殖的病菌數(shù)）的菌懸液。采用直接葉片噴菌液、針刺侵染菌液和注射器注射菌液3種方法接種具4～5葉的彩色馬蹄蓮幼苗，分別是將菌懸液直接噴灑在幼苗植株表面；用無菌牙簽蘸取細菌懸浮液針刺接種健康彩色馬蹄蓮葉片的葉片中部，噴水保濕，以滅菌水作為對照；將菌懸液用100 μL的醫(yī)用注射器注射到彩色馬蹄蓮葉片中部，每個處理注射10 μL，重復(fù)3次并用無菌水做對照，每12 h觀察發(fā)病情況。

1.2.5 馬蹄蓮品種的抗性鑒定

選取彩色馬蹄蓮品種ym008，ym011，ym044，ym063，ym068，ym048相同或相近繼代培養(yǎng)組織培養(yǎng)苗，移栽在裝有相同配比基質(zhì)的獨立花盆中，置在大棚中生長，具4～5個葉片時進行接種。

取致病性強的p3菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)24 h進行活化，用無菌水配成3個濃度1×108 CFU/mL，1×107 CFU/mL，1×106 CFU/mL的菌懸液。分別用注射器注射不同濃度菌懸液于具4～5葉期的葉片上，每處理重復(fù)6次，以無菌水做對照，觀察發(fā)病情況。

葉片發(fā)病癥狀分級：0級，葉片無病狀：1級，0<病斑面積≤10%總面積；2級，10%<病斑面積≤30%總面積；3級，30%<病斑面積≤50%總面積；4級，50%<病斑面積≤70%總面積；5級，70%<病斑面積≤100%總面積（總面積按直徑1.5 cm的圓面積計算）。

病情指數(shù)：高抗（HR）：0≤DI<25；抗（R）：25≤DI<45；中抗（MR）：45≤DI<65；感（S）：65≤DI<85；高感（HS）：85≤DI。

病情指數(shù)=100×∑（各級病葉數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級代表值）

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與分離菌株的鑒定

從楊武、大板橋、尋甸等不同區(qū)域采集的彩色馬蹄蓮病株上分離得到4個軟腐病菌株（圖1），分別命名為p1、p2、p3、p4，4株菌株均能引起發(fā)病。直接葉片噴菌液不能使彩色馬蹄蓮葉片發(fā)病，針刺侵染菌液和注射器注射菌均可以引起發(fā)病。葉片發(fā)病時，出現(xiàn)水浸狀病斑，隨著病情加重病斑向四周擴散，最終導致葉片腐爛，植株倒伏，該病菌接種癥狀與田間癥狀一致（圖2）。其中菌株p3致病性最強。

2.2 最適培養(yǎng)基的篩選

4種培養(yǎng)基配方中，用PDA和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離出的細菌數(shù)量平均都在100以上。PDA培養(yǎng)基分離到的菌落數(shù)量的最小值和最大值相差很大，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基菌落數(shù)量較為穩(wěn)定。LB培養(yǎng)基分離到的細菌數(shù)量相對穩(wěn)定，但沒有牛肉膏蛋白胨的數(shù)量多，TSA培養(yǎng)基每皿只分離到37個細菌，數(shù)量最少。綜合考慮，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離到的細菌數(shù)量和穩(wěn)定性是最優(yōu)的（表1）。

2.3 分離菌株的鑒定

分離到的菌落前期在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上為透明，灰白色，表面濕潤平滑微微隆起，后期為半透明，圓形。挑取純化的單個菌落，經(jīng)草酸銨結(jié)晶紫染色后，在油鏡下觀察，呈現(xiàn)紫色，菌體為短小桿狀（圖3）。革蘭氏染色反應(yīng)試驗顯示為革蘭氏陰性（圖4）。

以菌株p3基因組DNA為模板進行16S rDNA PCR擴增，獲得1條1.5 kb左右的特異性片段（圖5）。將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行BLAST比對分析。結(jié)果表明，該序列與胡蘿卜果膠軟腐桿菌（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum）相似性最高，達到99%。

2.4 不同彩色馬蹄蓮品種對p3菌株抗病性評價

用致病性強的p3接種測試品種，觀察24～72 h病菌侵染測試品種后的病情指數(shù)（表2）。結(jié)果表明，所有測試品種均為感病品種，同一品種隨接種菌液濃度增加發(fā)病程度逐漸加重，不同品種對軟腐病抗病性由強到弱的排序為：ym068、ym044、ym063、ym048、ym008、ym011。

3 結(jié)論與討論

軟腐病是影響彩色馬蹄蓮產(chǎn)業(yè)的重要病害。目前，該病的防治主要是靠嚴格的衛(wèi)生管理和使用滅菌泥炭等消毒基質(zhì)。但這些防治方法增加生產(chǎn)成本，提高投資門檻，極大地限制了彩色馬蹄蓮的發(fā)展。因此，篩選抗病種質(zhì)資源，選育抗病品種是控制彩色馬蹄蓮軟腐病的最佳途徑。本研究通過云南不同地區(qū)采集的彩色馬蹄蓮細菌性軟腐病病株分離得到病原菌，先進行菌株致病性研究，篩選出強致病力菌株p3，避免由于菌株致病性過弱導致的抗性評價的偏差。經(jīng)過回接試驗，該菌使得ym039再次感病。革蘭氏染色試驗確定該菌種為革蘭氏陰性接菌，16SrDNA分子鑒定顯示該菌與Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum相似度99%，確定該菌為胡蘿卜果膠軟腐桿菌。常用的細菌接種鑒定方法是針刺法和噴霧法。簡單噴霧法有時不利于接種，而針刺法可以給彩色馬蹄蓮幼苗葉片造成傷口，有利于病原菌對彩色馬蹄蓮的侵染，但抗病性是通過產(chǎn)生病斑大小進行鑒定，針刺法難以控制侵染的初始菌量[15]。本試驗用注射法即可以創(chuàng)造感染傷口又可以精確控制劑量。所以，本研究抗性鑒定采用10 μL注射法，將病原菌接種在ym008，ym011，ym044，ym063，ym068，ym048六個彩色馬蹄蓮品種，獲得中抗病品種ym068、ym044、ym063，為生產(chǎn)上推廣栽培應(yīng)用提供依據(jù)。

彩色馬蹄蓮的葉片、葉柄和種球等組織，常作為抗性能力篩選的活體材料，但仍然存在一些弊端[16]。一是容易造成資源浪費，提高鑒定成本；二是鑒定結(jié)果可能有誤差。室內(nèi)離體葉盤接種鑒定可以人為控制生長環(huán)境、菌液濃度和劑量，但鑒定結(jié)果不能完全體現(xiàn)出田間的抗病能力。因此，本實驗將相同或相近繼代培養(yǎng)代數(shù)的組培苗移栽至含有滅菌基質(zhì)的花盆中，在田間進行同質(zhì)化管理，并采用定量注射法（濃度相同、計量相同），從而達到快速準確鑒定馬蹄蓮抗病性的目的。

軟腐病是關(guān)系到彩色馬蹄蓮產(chǎn)業(yè)興衰的重要病害，利用現(xiàn)代分子技術(shù)如基因工程等對品種抗性差異作更深入的研究，培育彩色馬蹄蓮抗性品種，也可真正促進彩色馬蹄蓮產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[17]。

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