于 偉，張桂芳，甄井龍，宋雪建，遲曉星，王振宇*

藍靛果（Lonicera caerulea）屬忍冬科忍冬屬，是一種多年生灌木，多生長于東北、華北、西北等地區(qū)，不同地區(qū)別名也不同（如黑瞎子果（黑龍江）、狗奶子或羊奶子（黑龍江大興安嶺）、山茄子（黑龍江省七臺河市勃利縣）等），是一種適應(yīng)性較好的灌木[1-3]。藍靛果富含礦物質(zhì)、氨基酸、多酚及VC等多種對機體有利的活性物質(zhì)；具有抗氧化、抗病毒、抗疲勞、抗炎、抗輻射及改善肝功能等效果，具有極高的藥用價值[1-5]。其果皮富含大量紅色素，可以替代人工合成色素，更加安全健康；其果實多漿汁，種子極小，出汁率高，是制作飲料的極好原料[6-7]。藍靛果在其他方面也有用途，如使用酵母發(fā)酵可使果酒的酸度下降13.2%，因此可以應(yīng)用于高酸果酒的發(fā)酵[8]。其在模擬體外消化后，總酚含量提高48.2%，花色苷含量下降67.6%，單體花色苷種類減少，氧自由基吸收能力和總抗氧化能力分別降低80.0%和55.6%[9]。花色苷的酚羥基結(jié)構(gòu)對活性氧等自由基有很強的捕捉能力[10-13]?；ㄉ疹惢衔锿ㄟ^清除自由基，能對自由基誘發(fā)的生物大分子損傷起到保護作用，維持細胞膜的流動性和蛋白質(zhì)的構(gòu)型構(gòu)象，具有明顯抑制高血脂、預(yù)防心血管病的效果[14-16]。從葡萄中提取的花色苷可以有效地降低膽固醇和低密度脂蛋白水平，預(yù)防血栓形成，有助于預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生[17]。研究發(fā)現(xiàn)花色苷可使人體總膽固醇含量降低13%～26%，使低密度脂蛋白膽固醇含量降低21%～33%[18]，還可降低肝臟中甘油三酯含量[19]。綜上，藍靛果具有相當(dāng)廣闊的經(jīng)濟效益，值得開發(fā)利用。

本課題組在前期實驗中發(fā)現(xiàn)藍靛果花色苷可使肝臟丙二醛含量顯著降低，有效減少肝臟過氧化損傷，預(yù)防動脈硬化的發(fā)生[2]。目前，在藍靛果花色苷降低高脂血方面的研究雖然較多，但主要集中在血清脂肪酶、肝脂酶、脂代謝酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶與肝X受體（liver X receptor α，LXRα）、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2及三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC）G5等方面。劉素穩(wěn)[20]證明，藍靛果花色苷能激活過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）-LXRa-ABCA1/膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7a1）信號通路，促進膽固醇流出，加速膽固醇膽汁酸代謝，降低肝臟中的膽固醇含量，減少大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)積累，而B族I型清道夫受體（scavenger receptor class B, type I，SR-BI）是介導(dǎo)膽固醇逆轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵受體。為研究藍靛果花色苷降低血脂水平及預(yù)防動脈硬化的主要途徑及其作用機理，本實驗利用超聲輔助提取等方法從藍靛果中提取藍靛果花色苷，通過體內(nèi)實驗，利用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reactionm，qPCR）測定藍靛果花色苷對高脂血癥大鼠肝臟組織中LXRα、SB-BI、ABCG5、PPARγ及CYP7a1基因表達的影響，從基因表達水平上闡明藍靛果花色苷對膽固醇代謝相關(guān)基因的影響，并闡明藍靛果花色苷對與PPARγ-LXRa-ABCAl/CYP7al信號通路相關(guān)基因的作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

藍靛果花色苷由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國家雜糧工程技術(shù)研究中心實驗室自制。

2 月齡清潔級雄性Wistar大鼠60 只（許可證編號：SYXK（黑）2011-007） 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部；組織RNA提取試劑盒 美國OMEGA公司；焦碳酸二乙酯 上海信帆生物科技有限公司；SYBR Green qPCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、培養(yǎng)基、血清、雙抗、胰酶 美國Thermo Scientific公司；異丙醇、無水乙醇、氯仿 國藥集團藥業(yè)股份有限公司；小鼠巨噬細胞RAW264.7 上海北諾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7300型qPCR儀 美國ABI公司；TG-16M低溫冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；P2、P10、P20、P100、P200、P1000型移液槍 吉爾森P型移液器公司；K30漩渦振蕩器 上海青浦滬西儀器廠；PRO200電動勻漿機 德國弗魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 動物模型及分組

選擇2 月齡，清潔級雄性Wistar大鼠60 只，按體質(zhì)量隨機分成6 組，每組10 只。其中10 只為基礎(chǔ)飼料對照組，給予普通飼料；其余50 只給予高脂飼料（78.8%（質(zhì)量分數(shù)，下同）普通飼料、10.0%豬油、10.0%蛋黃粉、0.2%膽酸鈉、1.0%膽固醇）[21-22]，同時每籠每天添加輔食油渣50 g（約占每只雄鼠飼料攝入量的8%～10%），自由飲食飲水，每10 d稱一次體質(zhì)量。30 d后斷尾取血，測血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）濃度。30 d造模后，實驗性高脂血癥大鼠平均TG濃度（（3.48±1.37）mmol/L）極顯著高于基礎(chǔ)飼料對照組（（1.94±0.53）mmol/L）（P＜0.01）；實驗性高脂血癥大鼠平均TC濃度（（2.42±0.28）mmol/L）顯著高于基礎(chǔ)飼料對照組（（1.70±0.48）mmol/L）（P＜0.05），表明高脂飼料喂養(yǎng)的50 只大鼠均造模成功。將高脂血癥大鼠隨機分為5 組，分別為高脂血癥模型對照組（HFD，灌胃1.2 g/（kg·d）生理鹽水）、陽性對照組（PC，灌胃10 mg/（kg·d）辛伐他汀片）和藍靛果花色苷低（HFD+L）、中（HFD+M）、高（HFD+H）劑量組（分別灌胃4.0、40.0、120.0 mg/（kg·d）藍靛果花色苷），并設(shè)置基礎(chǔ)飼料正常對照組（ND，1.2 g/（kg·d）生理鹽水灌胃）[2]。大鼠灌胃5 周后，乙醚麻醉，解剖摘出臟器（心、肝、脾、腎），用手術(shù)剪去除結(jié)締組織后稱質(zhì)量，以臟器質(zhì)量與體質(zhì)量的百分比為臟器指數(shù)。

1.3.2 qPCR檢測肝臟SR-BI、LXRα、ABCG5、PPARγ及CYP7a1基因表達水平

稱取30 mg肝臟組織，常規(guī)Trizol試劑提取總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，程序為：37 ℃、60 min；85 ℃、5 min；4 ℃、5 min；產(chǎn)物置于－20 ℃保存。將制備好的cDNA進行qPCR擴增，程序為：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s；60 ℃、45 s，40 個循環(huán)；95 ℃、15 s；60 ℃、1 min；95 ℃、15 s；60 ℃、15 s。

使用NCBI引物設(shè)計工具設(shè)計qPCR擴增引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，具體見表1。

表1 qPCR引物Table 1 Primers of qPCR

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均以 ±s表示，T檢驗進行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著，以P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍靛果花色苷對高脂血癥大鼠臟器質(zhì)量的影響

表2 大鼠臟器指數(shù)Table 2 The ratio of viscera and body weights of rats%

由表2可以看出，在給予藍靛果花色苷干預(yù)后，與ND組相比：藍靛果花色苷各干預(yù)組心臟指數(shù)極顯著升高（P＜0.01）；HFD+H組肝臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；各組大鼠脾臟指數(shù)無明顯變化（P＞0.05）；HFD+H組腎臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05）。與HFD組相比：藍靛果花色苷干預(yù)各組大鼠脾臟指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）；HFD+M組肝臟指數(shù)極顯著降低（P＜0.01），腎臟指數(shù)、心臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。綜上，與HFD組比，除HFD+M組對高脂血癥大鼠的肝臟指數(shù)、心臟指數(shù)和腎臟指數(shù)有影響外，藍靛果花色苷各干預(yù)組對其他臟器指數(shù)幾乎沒有明顯影響。

2.2 藍靛果花色苷對于高脂血癥大鼠肝臟SR-BI、LXRα、ABCG5、PPARγ及CYP7a1 mRNA表達的影響

圖1 藍靛果花色苷對大鼠肝臟組織中SR-BI mRNA表達水平的影響Fig. 1 Effect of L. caerulea anthocyanin on mRNA expression of SR-BI in liver tissues of rats

如圖1所示，經(jīng)藍靛果花色苷干預(yù)后，高脂血癥大鼠肝臟中SR-BI mRNA表達水平幾乎不受影響（P＞0.05）。

圖2 藍靛果花色苷對大鼠肝臟組織中LXRα mRNA表達水平的影響Fig. 2 Effect of L. caerulea anthocyanin on mRNA expression of LXRα in liver tissues of rats

如圖2所示，經(jīng)藍靛果花色苷干預(yù)后，LXRα mRNA表達水平有所提高，HFD+M組（3.35±1.27）、HFD+H組（3.26±1.34）與ND及HFD組LXRα mRNA表達水平均存在極顯著差異（P＜0.01）；HFD+L組（1.62±0.52）僅與HFD組存在顯著差異（P＜0.05）。綜上，中、高劑量藍靛果花色苷對LXRα mRNA表達水平有明顯提高作用。

如圖3所示，藍靛果花色苷干預(yù)對高脂血癥大鼠ABCG5 mRNA表達水平無顯著影響（P＞0.05）。

如圖4所示，藍靛果花色苷干預(yù)后，高脂血癥大鼠PPARγ mRNA表達水平明顯降低，HFD+L（0.60±0.20）、HFD+M（0.45±0.32）、HFD+H（0.55±0.52）組與HFD組相比差異極顯著（P＜0.01）。表明藍靛果花色苷各干預(yù)組可以極顯著降低高脂血癥大鼠PPARγ mRNA表達水平（P＜0.01）。綜上，藍靛果花色苷對高脂血癥大鼠體內(nèi)與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、2型糖尿病及動脈硬化癥等相關(guān)的基因PPARγ的mRNA表達有抑制效果。

圖3 藍靛果花色苷對大鼠肝臟組織中ABCG5 mRNA表達水平的影響Fig. 3 Effect of L. caerulea anthocyanin on mRNA expression of ABCG5 in liver tissues of rats

圖4 藍靛果花色苷對大鼠肝臟組織中PPARγ mRNA表達水平的影響Fig. 4 Effect of L. caerulea anthocyanin on mRNA expression of PPARγ in liver tissues of rats

圖5 藍靛果花色苷對大鼠肝臟組織中CYP7a1 mRNA表達水平的影響Fig. 5 Effect of L. caerulea anthocyanin on mRNA expression of CYP7a1 liver tissues of rats

如圖5所示，在經(jīng)過藍靛果花色苷干預(yù)后，高脂血癥大鼠肝臟中CYP7a1 mRNA表達水平顯著增高，與ND組、HFD組相比，HFD+M和HFD+H組均具有極顯著差異（P＜0.01），而HFD+L組差異不顯著（P＞0.05）。表明中、高劑量藍靛果花色苷可以極顯著提升高血脂癥大鼠肝臟中CYP7a1 mRNA表達水平，并且中劑量藍靛果花色苷的提升作用最為明顯。

3 討 論

體內(nèi)核受體（nuclear receptor superfamily，NRs）可以調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)，通過內(nèi)源性和外源性配體物質(zhì)激活調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而達到對繁殖、發(fā)育、代謝和免疫應(yīng)答的穩(wěn)態(tài)控制[23]。LXRs屬于NRs超家族成員，有LXRα和LXRβ兩種同源亞型，其中LXRα分布廣泛，在肝臟、脂肪和巨噬細胞中表達較多，在大腦內(nèi)也有表達[24-25]。LXRs可以通過調(diào)控ABCG1來調(diào)控膜膽固醇在體內(nèi)的水平[24]，而LXRs的激活可以提高ABCG5及ABCG8的表達，將膽固醇轉(zhuǎn)移至回腸腔[25]。Hu Yanwei等[26]發(fā)現(xiàn)，LXRα siRNA可以阻止二氫辣椒堿（dihydrocapsaicin，DHC）誘導(dǎo)的ABCA1、ABCG1、ABCG5、SR-B1、LDLR、載脂蛋白A和載脂蛋白E表達提高，但對DHC誘導(dǎo)的PPARγ表達無影響；而PPARγ siRNA使DHC誘導(dǎo)的LXRα表達上調(diào)明顯下降，對PPARγ/LXRα通路的抑制會降低動脈粥樣硬化的發(fā)病率。劉偉治等[27]的研究表明，人LXRα受到LXRα、PPARγ基因的調(diào)節(jié)，人巨噬細胞中的LXRα?xí)l(fā)生自我催化現(xiàn)象，但是鼠中未發(fā)現(xiàn)此類現(xiàn)象。

CYP7a1是膽固醇合成膽汁的限速酶，CYP7a1也是LXRs的靶基因之一，LXRα可以調(diào)節(jié)CYP7a1的表達，影響膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)變[28-29]，CYP7a1的表達升高可以降低血漿膽固醇的含量[30-31]。脂肪分解相關(guān)基因CYP7a1能夠?qū)⒏闻K中的TC以膽汁酸的形式排出體外，從而降低肝臟中TC含量，提高ABCA1的表達[25,32]。LXRα通過調(diào)節(jié)尼曼匹克C1樣蛋白（niemann-pick C1 like 1，NPC1L1）和ABCG5及ABCG8異二聚體的表達，調(diào)節(jié)腸膽固醇吸收[25,32]，肝臟ABCG5及ABCG8水平過高會導(dǎo)致膽汁膽固醇水平升高，甚至達到過飽和[33-36]。申婷婷等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，通過對小腸膽固醇吸收、轉(zhuǎn)化等基因表達的抑制，上調(diào)腸道中促進膽固醇向外排泄基因ABCG5/8表達水平，可以調(diào)節(jié)膽固醇代謝。小腸中ABCG5/8可以調(diào)控膽固醇的吸收，促進膽固醇排向回腸[38-40]。雖然ABCG5和ABCG8可以抑制小腸膽固醇的吸收從而降低血清膽固醇水平，但本實驗中藍靛果花色苷并未對ABCG5基因表達產(chǎn)生影響。

PPARs是一種新型甾體類激素受體，也是配體激活轉(zhuǎn)錄因子，有PPARα、PPARβ、PPARγ 3 種亞型，PPARs可不同程度地被脂肪酸與其衍生物激活，參加脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)，其中PPARα和PPARγ在脂肪肝和IR的發(fā)生、發(fā)展中存在重要影響[41]。PPARγ mRNA的表達水平與IR呈正相關(guān)，而IR是2型糖尿病、肥胖癥、非酒精性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）及動脈硬化癥等疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ)[42-43]。本實驗結(jié)果顯示，藍靛果花色苷可以降低PPARγ mRNA的表達，而劉素穩(wěn)[20]的研究顯示，花色苷提取物可以提高肝臟內(nèi)PPARγ mRNA的表達。Yamauchi等[44]發(fā)現(xiàn)，可通過適度地抑制非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）/NASH及IR中PPARγ的活性，抑制前脂肪細胞的分化，減少白色脂肪組織、骨骼肌及肝臟中TG的含量，并增強脂肪酸的氧化程度，改善IR，使肝內(nèi)脂肪變性程度減輕。

SR-BI是介導(dǎo)膽固醇逆轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵受體，能夠引起膽固醇的雙向轉(zhuǎn)運。一方面，SR-BI可以介導(dǎo)外周細胞內(nèi)過剩的游離膽固醇流出，防止游離膽固醇過多堆積造成動脈粥樣硬化；另一方面，SR-BI可以與高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）結(jié)合，促進肝細胞攝取HDL中的膽固醇，使過剩的膽固醇回到肝臟進行進一步代謝。提高SR-BI基因的表達可以促進膽固醇外流，降低血漿膽固醇水平[45]。綜合來看，PPARγ、LXRα、CYP7a1等基因在膽固醇轉(zhuǎn)化過程中均起到非常重要的作用。

高脂血癥能夠?qū)е轮靖?、肝硬化、膽石癥、胰腺炎及動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生，而藍靛果花色苷可以降低TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇在血清中的含量，升高高密度脂蛋白膽固醇含量，有效降低肝臟過氧化損傷，預(yù)防動脈粥樣硬化的發(fā)生[2]。本實驗結(jié)果顯示，藍靛果花色苷對SR-BI及ABCG5 mRNA表達無影響，其通過降低PPARγ mRNA表達水平、提高LXRα及CYP7a1 mRNA表達水平來調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠的血脂水平，預(yù)防動脈粥樣硬化的發(fā)生。