張波波，高彩鳳，李云龍，王 敏,*

內(nèi)皮功能紊亂是血管形態(tài)及結(jié)構(gòu)損傷的病理基礎(chǔ)[1]，也是動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等多種疾病發(fā)生的早期環(huán)節(jié)[2-3]，且預(yù)防內(nèi)皮功能紊亂是預(yù)防或治療相關(guān)代謝性疾病的有效手段[4-5]。大量研究顯示，高脂飲食導(dǎo)致的脂代謝紊亂，尤其是血清中過高游離脂肪酸引起的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂的主要原因之一[6-8]。

NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）介導(dǎo)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一種“kindling radicals”，能夠引起其他途徑ROS的大量產(chǎn)生，如黃嘌呤氧化酶及一氧化氮合酶[9-10]。NOX家族共有7 個成員，其中NOX1、NOX2、NOX4、NOX5等亞型大量表達于內(nèi)皮細胞中[11-12]，然而NOX4在內(nèi)皮細胞中具有最高的表達量[13-14]，在引起內(nèi)皮功能障礙及動脈粥樣硬化中有關(guān)鍵作用[15]。說明抑制NOX4是減輕或預(yù)防內(nèi)皮功能紊亂的重要策略。

苦蕎具有預(yù)防心血管疾病、糖尿病等功效[16-17]，究其原因很可能是其生物活性物質(zhì)保護內(nèi)皮功能起效?？嗍w除富含淀粉、蛋白、多酚、黃酮外，還富含D-手性肌醇（D-chiro inositol，DCI）[18]。DCI是機體自身存在的物質(zhì)，在以內(nèi)皮功能紊亂為主要特征的糖尿病、多囊卵巢綜合征等患者體內(nèi)嚴重缺乏[19-20]，且補充DCI能顯著改善高血壓或糖尿病狀態(tài)下內(nèi)皮氧化應(yīng)激及功能紊亂[21-22]。但是DCI是否同樣能減輕非糖尿病等疾病狀態(tài)，如高脂刺激下內(nèi)皮功能障礙，且DCI保護內(nèi)皮功能的作用機制尚不明確，因此本實驗通過考察高脂及苦蕎麩皮提取物（tartary buckwheat bran extract，TBBE）對體外內(nèi)皮細胞、離體血管、在體動物血管中NOX4活性的影響，觀察對血管內(nèi)皮依賴性舒張的改變作用。探討提取物在高脂狀態(tài)下對內(nèi)皮功能的保護作用，為苦蕎等富含DCI食物的有效利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級體質(zhì)量200～250 g左右的SD大鼠及雄性5～6 周齡的ICR小鼠，飼養(yǎng)于中國藥科大學(xué)中藥藥理教研室SPF級動物室（許可證號：SCXK（Su）2012-0004）。高脂飼料由質(zhì)量分數(shù)（下同）0.2%膽鹽、1%膽固醇、10%豬油、10%蛋黃、78.8%基礎(chǔ)飼料組成。

TBBE（含35.7 g/100 g水、33.5 g/100 g DCI、0.33 g/100 g蘆丁，未檢測到槲皮素（＜0.02 g/100 g）），由山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供。

二苯基氯化碘鹽（diphenyleneiodonium chloride，DPI）、乙酰膽堿 美國Sigma公司；苯腎上腺素 TCI（上海）化成工業(yè)公司；棕櫚酸（palmitic acid，PA）國藥集團化學(xué)試劑有限公司；MTT、DCFH-DA探針碧云天生物技術(shù)研究所；Anti-NOX4 德國Abcam公司；游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FAs）試劑盒、血糖試劑盒 南京檢測生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光酶標儀及細胞培養(yǎng)箱 美國賽默飛公司；超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；倒置生物顯微鏡重慶光學(xué)儀器廠；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 南京科寶儀器研究所；轉(zhuǎn)膜儀及垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司；離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)、生物機能實驗系統(tǒng) 成都臺盟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)皮原代細胞的提取及培養(yǎng)

參照Li Yi等[6]的方法，并稍作修改。取SD大鼠乙醚麻醉后頸椎脫臼處死，75%體積分數(shù)乙醇溶液滅菌處理，在超凈臺中取出大鼠的胸主動脈，浸泡于含105U/L肝素鈉的DMEM培養(yǎng)液中，輕輕剝離血管外周結(jié)締組織和脂肪，使血管內(nèi)膜外翻并扎緊其兩端，用2 mg/mL的I膠原酶處理1.5 h（放于37℃的細胞培養(yǎng)箱中），取出血管將血管兩端剪掉，其他部分剪為長、寬均為2 mm的小塊，內(nèi)膜部分緊貼培養(yǎng)瓶底部，加入1 mL左右培養(yǎng)基，6 h后補加培養(yǎng)基，2～3 d即可觀察到內(nèi)皮細胞爬出。選擇3～6 代細胞進行實驗。

1.3.2 離體血管分組及PA處理

同1.3.1節(jié)剝離大鼠胸主動脈血管。設(shè)置空白組、PA刺激組、5.381 μg/mL的TBBE保護組及1 μmol/L的DPI保護組。空白組：大鼠胸主動脈血管用含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基孵育2.5 h。PA刺激組：大鼠胸主動脈血管用含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基孵育0.5 h后，添加PA（100 μmol/L）再孵育2 h。TBBE保護組：大鼠胸主動脈血管用含有5.381 μg/mL TBBE的DMEM培養(yǎng)基（10%血清）孵育0.5 h后，添加PA（100 μmol/L）再孵育2 h。DPI保護組：大鼠胸主動脈血管用含有1 μmol/L DPI的DMEM培養(yǎng)基（10%血清）孵育0.5 h后，添加PA（100 μmol/L）再孵育2 h。

1.3.3 小鼠分組及飼喂

設(shè)置空白組、高脂飼喂組、高脂飼喂+TBBE（76.47 mg/kg）灌胃組、高脂飼喂+TBBE（149.3 mg/kg）灌胃組、高脂飼喂+200 mg/kg的二甲雙胍（metformin，Met）灌胃組5 組，每組各10 只小鼠，共灌胃14 d?？瞻捉M：小鼠采用正常飼料飼喂，每天灌胃質(zhì)量分數(shù)0.3%的羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）。高脂飼喂組：小鼠采用高脂飼料飼喂，每天灌胃0.3%的CMC-Na。TBBE灌胃組：小鼠采用高脂飼料飼喂，每天灌胃用CMC-Na（0.3%）配制的不同劑量的TBBE（74.67 mg/kg或149.3 mg/kg）。Met灌胃組：小鼠采用高脂飼料飼喂，每天灌胃用CMC-Na（0.3%）配制的Met（200 mg/kg）。

小鼠胸主動脈血管的剝離：不同組別小鼠飼喂14 d后，頸椎脫臼處死，體積分數(shù)75%的乙醇溶液滅菌處理，迅速剖開小鼠腹腔，找到并小心取出小鼠胸主動脈血管。

1.3.4 MTT法考察提取物對細胞活性的影響

將1.3.1節(jié)中獲得的內(nèi)皮細胞接種于96 孔板，待生長約60%融合度的時候，對細胞進行不同劑量TBBE孵育（24 h），按照MTT試劑盒使用說明處理細胞，以570 nm波長處空白組細胞吸光度為100%，考察TBBE對細胞活性的影響。

1.3.5 細胞ROS及NOX4檢測

將1.3.1節(jié)中獲得的內(nèi)皮細胞接種于48 孔板，待生長約80%融合度的時候，對細胞進行不同劑量TBBE孵育及PA處理，使用DCFH-DA探針考察TBBE對細胞ROS產(chǎn)生的影響。將細胞接種于6 孔板，待生長約80%融合度的時候，對細胞進行不同劑量TBBE孵育及PA處理，提取細胞蛋白并定量，預(yù)先制備Western blot分離膠及濃縮膠，加入蛋白樣品，電泳，轉(zhuǎn)膜，對聚偏氟乙烯膜進行封閉、一抗及二抗孵育，壓片及顯影，考察提取物對NOX4蛋白活性的影響。

1.3.6 免疫組化分析大鼠離體血管及小鼠血管內(nèi)膜NOX4表達

收集1.3.2節(jié)中空白組、PA孵育及TBBE、DPI處理的大鼠胸主動脈，及剝離1.3.3節(jié)中空白組、高脂飼喂及TBBE、Met灌胃處理小鼠的胸主動脈血管。

離體血管（大鼠）及在體血管（小鼠）經(jīng)磷酸鹽緩沖液清洗后，分別使用4%聚甲醛固定。對血管進行脫水，石蠟包埋，切片，脫水處理，再使用二甲苯和不同濃度乙醇溶液對切片進行脫蠟處理，檸檬酸緩沖液蒸煮切片20 min使抗原暴露，滴加體積分數(shù)3% H2O2溶液消除內(nèi)源性過氧化氫酶減少背景，用3% BSA在濕盒中對切片進行封閉1 h，依次對切片進行一抗（anti-NOX4）、二抗及SABC孵育，滴加DAB顯色劑，蘇木素復(fù)染，不同濃度乙醇溶液及二甲苯對切片進行脫水處理，封片。顯微鏡下觀察提取物對血管內(nèi)膜NOX4表達的影響。

1.3.7 大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張的檢測

參照Li Jia等[24]的方法，略作修改。如1.3.1節(jié)剝離及處理大鼠胸主動脈血管，放入K-H液中，制備為1 cm長的血管環(huán)，懸掛在37 ℃預(yù)熱的K-H液浴槽的兩根相同長度且平行放置的鋼絲間，通入95% O2及5% CO2，打開生物機能實驗系統(tǒng)收集血管張力信號，調(diào)節(jié)血管基礎(chǔ)張力2 g，平衡1.5 h。

先用60 mmol/L氯化鉀處理10 min使血管收縮，K-H液沖洗血管使之恢復(fù)至基礎(chǔ)張力，重復(fù)使血管收縮、恢復(fù)基礎(chǔ)張力共3 次，加入1×10－6mol/L苯腎上腺素使血管處于收縮狀態(tài)10 min，添加1×10－5mol/L乙酰膽堿，若血管舒張大于80%，可認為其內(nèi)皮功能完整。選取內(nèi)皮功能完整的血管環(huán)與5.381 μg/mL的TBBE或1 μmol/L的DPI共孵育30 min，繼而加入100 μmol/L PA處理30 min，K-H液沖洗使之恢復(fù)基礎(chǔ)張力，加入1×10－6mol/L苯腎上腺素導(dǎo)致血管收縮10 min，依次累積添加1×10－9、1×10－8.5、1×10－8、1×10－7.5、1×10－7、1×10－6.5、1×10－6、1×10－5.5、1×10－5mol/L乙酰膽堿舒張血管。記錄并計算空白組、PA處理組、TBBE干預(yù)或DPI干預(yù)組血管舒張率。血管舒張率根據(jù)式（1）計算。

1.3.8 小鼠血清及組織指標的檢測

兩周后，禁食8 h，稱小鼠體質(zhì)量，摘眼球取血，收集并獲得血清，檢測血糖及FFAs水平，收集附睪脂肪及肝臟并稱質(zhì)量，分別根據(jù)公式（2）、（3）計算附睪脂肪系數(shù)及肝臟系數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Western blot圖及免疫組化圖使用Image-Pro Plus 6軟件掃描光密度值。實驗所得數(shù)據(jù)表示為 ±s，進行ANOVA方差分析和t檢驗，PS軟件作圖。P＜0.05及P＜0.01均表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎麩皮DCI對內(nèi)皮細胞活性的影響

圖1 TBBE劑量對細胞存活狀態(tài)的影響Fig. 1 Effect of TBBE concentration on the viability of cells

如圖1所示，以空白組細胞相對存活率為100%，低于50 μg/mL對細胞相對存活率沒有顯著影響，100.00 μg/mL則降低細胞活性。因為0.053 81、0.538 1、5.381 μg/mL的TBBE分別相當于0.10、1.00、10.00 μmol/L的DCI，這也是大多細胞研究采用的劑量[22]；因此，本研究中采用0.053 81～5.381 μg/mL劑量TBBE進行后續(xù)的細胞實驗。

2.2 苦蕎麩皮DCI對內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激的影響

NOX4是內(nèi)皮細胞中含量最多的NOX亞型[14]，NOX活性的高低顯示了細胞氧化應(yīng)激的水平，其激活是導(dǎo)致細胞氧化應(yīng)激的重要原因[25]，也是內(nèi)皮功能損傷的重要誘導(dǎo)因素[26]。因此，進一步考察TBBE對內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激及NOX4相對活力的影響。

圖2 TBBE抑制PA引起的細胞ROS產(chǎn)生（A）及NOX4相對活力（B）Fig. 2 TBBE inhibited PA-induced ROS production (A) and NOX4 relative activity (B) in cells

本研究結(jié)果表明（圖2A），PA處理導(dǎo)致內(nèi)皮細胞ROS水平顯著升高，而不同劑量TBBE干預(yù)有效降低細胞內(nèi)ROS的水平（P＜0.01）。且陽性藥DPI（NOX活性抑制劑）顯著降低ROS水平。說明藥理抑制NOX活性能有效抑制細胞氧化應(yīng)激，然而TBBE降低ROS的作用是否與抑制NOX活性有關(guān)，仍需進一步考察。

由圖2B可知，PA組顯著提高內(nèi)皮細胞NOX4的表達（P＜0.01），而NOX4表達提高即意味著其活性升高，說明PA引起ROS產(chǎn)生依賴于對NOX4的激活，3 種劑量的TBBE干預(yù)組均有效抑制NOX4相對活力。雖然研究報道苦蕎具有抑制氧化應(yīng)激的作用[27]，且黃酮多酚等是苦蕎食品中重要的抗氧化物質(zhì)[28]，但該提取物富含DCI，僅含0.33 g/100 g的蘆丁，未檢測到槲皮素（小于0.02 g/100 g）。提示DCI可能是TBBE發(fā)揮功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，TBBE可通過調(diào)節(jié)NOX4相對活力抑制細胞氧化應(yīng)激。

2.3 苦蕎麩皮DCI對離體血管內(nèi)膜NOX4及血管舒張的影響

由于TBBE顯著抑制內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激。但在離體組織中提取物是否有相似作用，是否進而可以保護內(nèi)皮功能，因而對離體血管進行免疫組化分析NOX4相對活力并考察提取物對血管舒張的影響。

圖3 TBBE抑制PA引起的大鼠離體血管內(nèi)膜NOX4相對活力Fig. 3 TBBE inhibited PA-induced NOX4 relative activity in thoracic aorta of rats in vitro

由圖3可知，與空白組相比，PA刺激組離體血管內(nèi)膜部分棕色顏色加深，即NOX4表達升高，而5.381 μg/mL的TBBE干預(yù)組血管內(nèi)膜NOX4表達減少，DPI組顯示出與TBBE組相似的抑制NOX4相對活力的作用。說明TBBE可以在離體組織層面抑制NOX4相對活力，并可能抑制氧化應(yīng)激。

圖4 TBBE促進血管的內(nèi)皮依賴性舒張Fig. 4 TBBE restored the loss of endothelium-dependent relaxation of thoracic aorta

不同處理組的血管舒張率見圖4?？瞻捉M表示血管內(nèi)皮功能完整，PA刺激后血管舒張率極顯著降低（P＜0.01），說明PA具有刺激損傷內(nèi)皮功能。TBBE干預(yù)組血管舒張率與PA組相比有顯著提高，說明TBBE改善高脂狀態(tài)下內(nèi)皮功能紊亂現(xiàn)象。DPI與TBBE有相似作用。

苦蕎中多種成分，如蘆丁、槲皮素、中肌醇、DCI等均可抑制氧化應(yīng)激，進而保護內(nèi)皮功能[22-23]。由于本研究中TBBE富含DCI，僅含有0.85 g/100 g的中肌醇及微量蘆丁物質(zhì)，因此提示TBBE保護內(nèi)皮的作用極有可能是DCI起到了主要作用，且TBBE通過抑制NOX4活性從而改善離體血管舒張作用，進一步闡明苦蕎預(yù)防心血管疾病的機理。

2.4 苦蕎麩皮DCI對在體小鼠血管內(nèi)膜NOX4及相關(guān)指標的影響

因為細胞及離體組織均是體外研究，因此希望在體內(nèi)進一步驗證TBBE對小鼠內(nèi)皮功能及其他指標的影響。因而考察TBBE對HFD小鼠血管內(nèi)膜NOX4及對小鼠血清葡萄糖、FFAs、附睪脂肪系數(shù)、肝臟系數(shù)及體質(zhì)量的影響。

圖5 TBBE抑制HFD引起的小鼠血管內(nèi)膜NOX4相對活力Fig. 5 TBBE inhibited HFD diet-induced NOX4 relative activity in thoracic aorta of mice in vivo

由圖5可知，高脂處理提高了小鼠血管內(nèi)膜部分棕色顆粒的增多，即NOX4相對活力升高，灌胃74.67、149.3 mg/kg（相當于25、50 mg/kg的DCI）的TBBE有效降低了小鼠血管內(nèi)膜部分NOX4的相對活力，可能進一步抑制HFD小鼠血管氧化應(yīng)激現(xiàn)象。

表1 提取物對小鼠血清指標及組織系數(shù)的影響Table 1 Effect of TBBE on blood glucose, FFAs, and epididymal fat coefficient, liver coefficient and body mass of mice

由表1可知，HFD引起小鼠血清中FFAs濃度顯著升高，提示高脂造成過量FFAs可能與小鼠血管內(nèi)皮細胞NOX4相對活力升高有關(guān)。而不同劑量TBBE能有效降低血清中FFAs的水平，該作用可能有助于TBBE在高脂狀態(tài)下抑制內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激并保護內(nèi)皮功能。另外，高脂飼喂14 d并沒有引起小鼠血糖水平升高，說明此時小鼠模型處于非高血糖或糖尿病狀態(tài)。高脂飼喂以及提取物灌胃處理對小鼠附睪脂肪系數(shù)、肝臟系數(shù)及體質(zhì)量均無顯著影響，說明此時小鼠沒有出現(xiàn)肥胖等現(xiàn)象。本部分研究顯示，TBBE可以逆轉(zhuǎn)非糖尿病或非肥胖狀態(tài)下高脂引起的內(nèi)皮功能損傷，也進一步揭示了合理食用苦蕎具有保護內(nèi)皮功能。

內(nèi)皮是多種疾病的始動環(huán)節(jié)，且預(yù)防內(nèi)皮功能紊亂有效延緩相關(guān)疾病的發(fā)生[4-5]。大量文獻表明，蕎麥具有治療動脈粥樣硬化[29]、減輕高血壓癥狀[30]及降低高血糖[31]等作用，但本研究提出富含DCI的苦蕎提取物具有保護高脂狀態(tài)下內(nèi)皮功能的作用，該活性可能有助于苦蕎預(yù)防或治療多種以內(nèi)皮功能紊亂為早期特征的疾病，如心血管疾病及糖尿病等。

3 結(jié) 論

在內(nèi)皮細胞中，TBBE顯著抑制PA引起的ROS的產(chǎn)生及NOX4相對活力，可知苦蕎麩皮DCI提取物能降低NOX4相對活力并抑制內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激。

在離體血管組織中，TBBE有效抑制血管內(nèi)膜NOX4的表達，并顯著恢復(fù)因PA造成的血管內(nèi)皮依賴性舒張受損（P＜0.01），且抑制NOX4相對活力也明顯改善血管舒張功能。說明苦蕎麩皮DCI可通過抑制NOX4相對活力改善高脂狀態(tài)下血管的舒張。

高脂飼喂小鼠后，灌胃TBBE可明顯降低非糖尿病或非肥胖狀態(tài)下脂毒性引起的血管內(nèi)膜NOX4激活現(xiàn)象。本研究從細胞、離體組織、在體動物3 個層面，揭示苦蕎能夠改善高脂狀態(tài)下內(nèi)皮功能紊亂并可能因此具有預(yù)防或治療多種心血管疾病、糖尿病等的作用。