朱 坤，丁米娜，楊 洋，車拴龍，陳麗艷,*

乳腺癌是全世界婦女中最常見的癌癥之一，也是女性癌癥死亡的主要原因[1]。在我國由于“西化的生活方式”和亂用外源性雌激素等原因，乳腺癌發(fā)病率有逐年增加的趨勢[2]。因此，探究乳腺癌發(fā)病機(jī)制，尋找新的乳腺癌治療藥物成為研究的熱點(diǎn)。近年來，從食品和中藥中提取的抗癌藥物因其副作用小、有效成分含量高而備受國內(nèi)外研究者的關(guān)注。

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand. Mazz.）為菊科（Compositae）蒲公英屬（Taraxacum F.H.Wigg.）多年生草本植物[3]，在我國分布廣泛、產(chǎn)量高且價格低廉。蒲公英具有清熱解毒、消腫散結(jié)的功效，可全草入藥，是菜藥兼用佳品，不僅具有藥用價值，而且是一種營養(yǎng)價值很高的野生蔬菜，是開發(fā)綠色天然植物營養(yǎng)保健品的寶貴資源。蒲公英研究歷史已有數(shù)千年，在婦科中主要為治療乳癰腫痛良藥[4]。清代《本草正義》中有“蒲公英，其性清涼，治乳癰乳疔，紅腫堅(jiān)塊，尤為捷效”的描述[5]。有研究發(fā)現(xiàn)噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）法檢測口服蒲公英提取液的大鼠尿液對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖具有抑制作用，并指出蒲公英萜醇、羽扇豆醇很有可能是此抑制作用的活性物質(zhì)[6]。蒲公英萜醇屬于烏蘇烷型五環(huán)三萜類化合物，在蒲公英、杜香、檀香葉、紫菀等中藥中均有分布，其分子式是C30H50O，相對分子質(zhì)量為426.729，可溶于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）[7-8]。近年研究表明蒲公英萜醇可以抑制胃癌、宮頸癌等腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9-10]，但其在抑制乳腺癌中的作用和機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究蒲公英萜醇對乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探討其可能的分子機(jī)制，為蒲公英萜醇的醫(yī)療開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳腺癌細(xì)胞系MCF-7為延邊大學(xué)腫瘤研究中心提供；蒲公英萜醇 西安昊軒生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、Hoechst 33342染料 美國Thermo公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿、移液管、96 孔板 美國Corning公司；青霉素、鏈霉素 碧云天生物技術(shù)研究所；胰蛋白酶、MTT、DMSO 北京華美公司；熒光猝滅封固液 北京索萊寶科技有限公司；Western blot相關(guān)抗體 美國Cell Signaling公司；脫脂奶粉美國BD公司；Tris-HCl（1 mol/L，pH 8.8及pH 6.8）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%丙烯酰胺 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG 美國Sigma公司；ECL試劑盒 美國Pierce公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HERA-Cell 150 CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；DYCZ-40D型迷你轉(zhuǎn)印電泳儀 北京六一儀器廠；BX53倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Infinite 200 PRO全波長多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 藥品配制

蒲公英萜醇用DMSO溶解，12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L蒲公英萜醇的培養(yǎng)基中DMSO質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.005%、0.01%、0.02%、0.04%、0.08%，－20 ℃分裝保存，使用前解凍。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮中取出凍存的人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7并快速置于37 ℃水浴迅速使其融化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，1 000 r/min離心4 min，棄上清液，使用含10% FBS及青霉素與鏈霉素各100 U/mL的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況，待細(xì)胞長至70%～80%時消化傳代。

1.3.3 MTT法細(xì)胞相對活力檢測

將對數(shù)生長期的細(xì)胞2×103個/孔接種于96 孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后加入終濃度為12.5、25.0、50.0、100.0 和200.0 μmol/L蒲公英萜醇，每組設(shè)8 個平行復(fù)孔，對照組加入等體積的培養(yǎng)液。于24、48、72 h后每孔加入配制好的MTT溶液100 μL孵育4 h；去液體，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解，應(yīng)用全波長多功能酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測每孔的吸光度，并按下式計(jì)算細(xì)胞相對活力。

1.3.4 細(xì)胞集落形成測定（平板克隆實(shí)驗(yàn)）

取對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞，離心后把細(xì)胞重懸在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用。將細(xì)胞懸液接種至6 孔板（500 個/孔），每孔0.2 mL培養(yǎng)液。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，加入50、100 μmol/L蒲公英萜醇處理細(xì)胞48 h，換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，兩周后出現(xiàn)鏡下可見的克隆，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗兩次。加入1 mL甲醇固定30 min。棄去甲醇，加1 mL Gimsa染色液染色30 min，然后用自來水緩慢洗去染色液，室溫干燥。

1.3.5 Hoechst 33342熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡

蓋玻片于無水乙醇中浸泡2 h以上并于紫外照射后，放入6 孔板中，將細(xì)胞接種于6 孔板，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞融合度達(dá)到60%時采用如1.3.4節(jié)藥物處理，其對照組用普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后棄去上清液，PBS清洗一次后加1 mL甲醇固定15 min，棄甲醇，PBS洗兩次，加入PBS配制的Hoechst 33342染色液0.5 mL，避光孵育30 min。去染色液，用PBS洗兩遍，吸盡液體滴一滴抗熒光猝滅封片劑于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，使細(xì)胞接觸封片劑，盡量避免氣泡。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.3.6 Western blot檢測

待細(xì)胞飽和度達(dá)到70%～80%，以預(yù)冷的PBS清洗3 次，加入RIPA裂解液提取總蛋白；Bradford法測定蛋白質(zhì)量濃度；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上；用TBST配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，加入一抗后4 ℃過夜；次日室溫下TBST洗膜，加入相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，ECL試劑盒顯色、成像。β-actin蛋白作為內(nèi)參，用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行掃描和定量分析，計(jì)算目標(biāo)蛋白條帶灰度/內(nèi)參條帶灰度的比值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次以上，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英萜醇抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖作用

圖1 蒲公英萜醇對MCF-7細(xì)胞增殖的影響Fig. 1 Effect of taraxerol on the proliferation of MCF-7 human breast cancer cells

由圖1可知，用不同濃度（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L）蒲公英萜醇處理MCF-7細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，24 h后的給藥組細(xì)胞增殖抑制效果不明顯；48 h后，給藥組細(xì)胞增殖受到明顯抑制，且隨著濃度增加，細(xì)胞增殖能力下降（P＜0.05）。提示蒲公英萜醇對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.2 細(xì)胞克隆形成情況

圖2 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測蒲公英萜醇對MCF-7細(xì)胞克隆形成的抑制作用Fig. 2 Taraxerol inhibited colony formation in MCF-7 human breast cancer cells as detected by the plate colony-forming assay

由圖2可知，平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞經(jīng)蒲公英萜醇（50.0、100.0 μmol/L）處理48 h并換為正常培養(yǎng)液培養(yǎng)兩周后，與對照組相比，克隆集落形成數(shù)量明顯減少；提示蒲公英萜醇可顯著抑制MCF-7細(xì)胞的增殖與克隆形成能力。

2.3 Hoechst 33342染色觀察細(xì)胞核微型態(tài)變化

圖3 Hoechst 33342染色檢測蒲公英萜醇誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡Fig. 3 Taraxerol exacerbated the apoptosis of MCF-7 human breast cancer cells as evaluated by Hoechst 33342 staining

由圖3可知，經(jīng)不同濃度（50.0、100.0 μmol/L）蒲公英萜醇處理48 h后，MCF-7細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生改變，對照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則且呈均勻藍(lán)色熒光（圖中未顯示），染色質(zhì)分散，細(xì)胞核呈橢圓形；藥物組細(xì)胞數(shù)量變少，呈致密濃染，顏色發(fā)白發(fā)亮，可見染色質(zhì)凝集、核固縮或碎裂為小核，形成凋亡小體等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征。蒲公英萜醇濃度愈高，細(xì)胞凋亡愈顯著。

2.4 Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖4 蒲公英萜醇對MCF-7細(xì)胞的Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of taraxerol on the expression of Bcl-2 and Bax in MCF-7 human breast cancer cells

圖5 蒲公英萜醇對MCF-7細(xì)胞的Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和PARP蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of taraxerol on the expression of cleaved caspase-3,cleaved caspase-9 and PARP in MCF-7 human breast cancer cells

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度（50.0、100.0 μmol/L）蒲公英萜醇處理48 h后Bax蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），Bcl-2蛋白的表達(dá)極顯著下調(diào)（P＜0.01），因而Bax/Bcl-2表達(dá)極顯著增加（P＜0.01）（圖4）；同時，給藥組Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白的表達(dá)極顯著上調(diào)（P＜0.01），PARP表達(dá)極顯著下調(diào)（P＜0.01）（圖5）；提示蒲公英萜醇可通過線粒體途徑誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡。

3 討 論

蒲公英被譽(yù)為“天然抗生素”，具有營養(yǎng)保健作用，有著悠久的食用和藥用歷史。隨著對其開發(fā)利用價值的深入研究，其醫(yī)療保健功能逐漸受到重視。近年研究表明，蒲公英抗腫瘤的有效成分主要為多糖、三萜、黃酮、酚酸、植物甾醇等天然活性物質(zhì)成分[11]。三萜類化合物是一類具有廣泛抗腫瘤等生物活性的化合物，在自然界中資源廣泛，對乳腺癌、直腸癌、肺癌等多種腫瘤均具有顯著的抑制效果。蒲公英萜醇屬五環(huán)三萜類化合物，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蒲公英萜醇可抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖，并通過線粒體途徑誘導(dǎo)凋亡的方式發(fā)揮其抗腫瘤作用[12-14]。

MTT比色法是檢測活細(xì)胞數(shù)量的常用方法[15]，在代謝過程中，活細(xì)胞線粒體與NADP相關(guān)的脫氫酶可以將黃色的MTT還原為藍(lán)色甲瓚結(jié)晶，通過酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測吸光度，從而檢測出細(xì)胞的存活率[16-17]。本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度的蒲公英萜醇處理人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 24、48、72 h后，發(fā)現(xiàn)48、72 h產(chǎn)生明顯抑制細(xì)胞增殖的作用，且該抑制作用呈濃度依賴性。細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過程中，單個細(xì)胞分裂繁殖6 代以上的后代組成的細(xì)胞群體，稱為集落或克隆。集落形成率表示細(xì)胞獨(dú)立生存能力。因此，本實(shí)驗(yàn)采用平板克隆實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測蒲公英萜醇對MCF-7細(xì)胞生長抑制的影響，結(jié)果顯示蒲公英萜醇能有效抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和集落形成。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞在生理病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)性、程序性死亡[18]，它與癌癥等許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡是許多抗癌藥物作用的主要機(jī)制之一。細(xì)胞凋亡首先表現(xiàn)為形態(tài)學(xué)改變，因此細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察成為判斷細(xì)胞凋亡最基本和可靠的方法。Hoechst染色是一種經(jīng)典而又快速的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法[19]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，與鄰周細(xì)胞脫離，胞漿聚縮，核染色體密度增加，呈半月形，且在核膜周邊凝集，核仁發(fā)生裂解，細(xì)胞內(nèi)陷，進(jìn)而形成凋亡小體。本實(shí)驗(yàn)通過熒光顯微鏡觀察結(jié)果，從形態(tài)學(xué)上證實(shí)蒲公英萜醇能夠誘發(fā)MCF-7細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)特征，且呈劑量依賴性。

有研究發(fā)現(xiàn)蒲公英萜醇主要通過線粒體途徑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，且可以誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)和促凋亡蛋白Bax的上調(diào)[20]。Bcl-2家族是一類與凋亡密切相關(guān)的調(diào)節(jié)基因，研究表明，Bcl-2和Bax蛋白水平高低與凋亡調(diào)控直接相關(guān)，Bax與Bcl-2的比值可以決定細(xì)胞在受凋亡刺激后的生存能力[21-24]。在細(xì)胞凋亡的過程中，Caspase-3和Caspase-9常被作為細(xì)胞線粒體凋亡途徑的早期檢測指標(biāo)，而PARP是一種DNA修復(fù)酶和最具特征性的蛋白酶解底物，當(dāng)細(xì)胞損傷過度時，細(xì)胞凋亡啟動使PARP發(fā)生水解[25-26]。為了進(jìn)一步闡明蒲公英萜醇誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)生凋亡的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)研究了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蒲公英萜醇給藥組可明顯上調(diào)Bax/Bcl-2比值，同時誘導(dǎo)Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達(dá)上調(diào)，PARP表達(dá)下調(diào)，表明蒲公英萜醇可活化Bcl-2和Bax，激活Caspase-3和Caspase-9，被激活的Caspase-3將PARP裂解，促進(jìn)DNA斷裂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27-28]。以上結(jié)果提示蒲公英萜醇可通過線粒體途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，蒲公英萜醇對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖具有良好的抑制作用，并可通過線粒體途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，但對其抗腫瘤作用潛在的多種分子機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。