肖 瀛，吳其國，尹志婷，周一鳴，周小理，胡中志

衰老是機體組織器官發(fā)生退行性變化、導致機體功能下降和功能紊亂不斷加重的過程，易出現(xiàn)如記憶力下降，糖、脂代謝紊亂，肝、腎功能異常等癥狀[1-2]。隨著年齡的增長，體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)機能減退，造成自由基堆積，是導致衰老的主要原因之一。過多的自由基可攻擊核酸、蛋白質(zhì)及酶類等生物大分子，造成DNA變異及酶活性下降[3]。氧化性損傷會造成細胞損傷和凋亡，導致多種與年齡相關的慢性疾病惡化，如阿爾茨海默癥、帕金森病、糖尿病[4-6]等。原花青素是一種由兒茶素或表兒茶素單體聚合而成的化合物，在植物界分布廣泛，且常見于日常食品中，如葡萄、松樹皮、紅酒[7-8]等。眾多研究證實原花青素具有較強的生物活性，在清除自由基、抗氧化、抗癌、治療糖尿病和心血管保護等方面[9-11]有顯著效果，其中原花青素B2在各類食物原花青素中分布最廣，且抗氧化活性強，但目前的研究主要以原花青素提取物作為研究對象，鮮有單一成分原花青素對抗衰老功能評價的報道，且其機理并不明確。

代謝組學是一種快速對生物體內(nèi)所有內(nèi)源性代謝產(chǎn)物進行定性、定量分析，并尋找代謝物與生理變化相對關系的研究方式，其通過鑒別潛在生物標志物來評價機體反映的細微生理應激，為探索整個機體功能提供重要信息[12-15]。目前尚鮮有從代謝組學角度探究原花青素B2抗衰老的機理研究。因此，本研究采用D-半乳糖誘導的衰老小鼠為模型，考察其學習記憶力，評價原花青素B2的抗衰老作用，基于液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（liquid chromatography quadrupole-time-of-flight mass spectrometer，LC-Q-TOF-MS）代謝組學技術，解析原花青素B2改善衰老的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

4 周齡雄性C57BL/6小鼠（SPF級，體質(zhì)量（15±1）g）購于上海靈暢生物科技公司，許可證號：SCXK（滬）2013-0018。

原花青素B2（純度≥90%） 上海同田生物技術有限公司；D-半乳糖、肝素鈉（分析純） 上海阿拉丁生化科技公司；無水乙醇、乙醚（分析純） 國藥集團上?；瘜W試劑公司；總抗氧化力（total antioxidant capacity，T-AOC）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒 南京建成生物研究所。

1.2 儀器與設備

DF-1156型低溫冰箱 日本三洋電機公司；3k-18型離心機 德國Sigma公司；曠場實驗、Y型食物誘導型迷宮（簡稱Y型迷宮）、Morris水迷宮及動物行為學視頻分析軟件 上海欣軟信息科技公司；LC-Q-TOF-MS（配備1290 Infinity LC系統(tǒng)、6530 UHD Q-TOF-MS）美國Agilent公司；PURELAB Classic型超純水機 英國ELGA公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與給藥

小鼠飼養(yǎng)在室溫為（22±2）℃、12 h晝夜交替的動物房內(nèi)，自由攝食和飲水。動物購買后適應性喂養(yǎng)1 周，隨機分為3 組：對照組（A組）、模型組（B組）、原花青素B2組（C組），每組9 只，每籠4～5 只。對照組喂以標準飼料AIN93G，并每天皮下注射0.86%（質(zhì)量分數(shù)，下同）生理鹽水10 mL/kg；模型組給予標準飼料，每天皮下注射10% D-半乳糖10 mL/kg；原花青素B2組喂以原花青素干預飼料（AIN93G+0.2%原花青素B2），同時注射10% D-半乳糖10 mL/kg，持續(xù)6 周。實驗期間每周一稱體質(zhì)量一次，并根據(jù)小鼠體質(zhì)量的變化調(diào)整注射劑量。

1.3.2 行為學實驗

1.3.2.1 曠場實驗

實驗第5周進行行為學實驗。曠場迷宮底部設為4×4方格，中央4 格為中心區(qū)域，其他為邊周區(qū)域。將小鼠放入曠場迷宮的中心位置，視頻記錄5 min內(nèi)小鼠的活動情況。觀察小鼠的總活動量、中心區(qū)域的活動時間及路程。

1.3.2.2 Y型迷宮實驗

Y型迷宮由3 個夾角120°且相同的臂組成，隨機設為起始臂、食物臂、新異臂。實驗包含兩個階段，間隔1 h。第1階段為訓練期，新異臂用隔板擋住，食物臂中放入一小塊巧克力，小鼠由起始臂放入，在起始臂和食物臂中自由活動10 min。訓練結束后，小鼠放回飼養(yǎng)籠。1 h后進入第二階段。第2階段為檢測期，抽開新異臂隔板，小鼠由起始臂放入，在3 個臂中自由活動5 min。統(tǒng)計小鼠進入食物臂的次數(shù)及停留時間。

1.3.2.3 Morris水迷宮實驗

Morris水迷宮主要由圓形水池（直徑1.2 m、高50.0 cm）和逃生平臺（直徑9.0 cm）組成。實驗時將水池內(nèi)的水用鈦白粉染成乳白色，以隱藏平臺，水面高于逃生平臺1 cm，將水池平均分成4 個象限，將不同形狀的參照物掛于各個象限的池壁內(nèi)側(cè)并高于水面，作為小鼠尋找平臺的標記物，在實驗期間保持固定。實驗室掛窗簾嚴密避光，且整個水池周圍掛遮光窗簾，保證內(nèi)部無燈光直射，水溫控制在（22±1）℃。

實驗歷時6 d，每天每只小鼠訓練4 次，每次以隨機方式從第一、二、三、四象限選擇一個入水點，將小鼠面向池壁放入水中。讓小鼠在60 s內(nèi)找到逃生平臺并停留10 s，記錄尋找平臺所需的時間，即為潛伏期（即小鼠進入泳池后第一次找到平臺所需的時間）。若未能尋找到平臺，則由實驗者用手引導至平臺停留30 s。每次訓練后用取暖器烘干小鼠，以免低溫造成的應激。第6天撤除平臺，將小鼠從平臺的對角象限置于水中，游泳60 s，記錄平臺潛伏期、穿越平臺次數(shù)、平臺象限活動時間及路程。

1.3.3 樣品采集

小鼠飼養(yǎng)7 周后稱質(zhì)量，乙醚麻醉后眼球取血，置于肝素鈉抗凝管中，頸椎脫臼處死小鼠后立即解剖，取出肝、腦、腎組織，分別在冰浴條件下用生理鹽水勻漿，制成質(zhì)量分數(shù)10%的組織勻漿液。血液在4 ℃、3 000 r/min條件下離心15 min，取上清獲得血漿，組織勻漿液于4 ℃、6 000 r/min條件下離心15 min取上清液，樣品保存在－80 ℃的冰箱中待測。

1.3.4 抗氧化指標的測定

取組織勻漿上清液，按照試劑盒說明書方法測定SOD活力、MDA含量、GSH-PX活力以及T-AOC。

1.3.5 LC-MS代謝組學分析

血漿樣本置于室溫解凍，用移液槍吸取100 μL血漿樣本于1.5 mL EP管中。加入300 μL甲醇及10 μL內(nèi)標（2.9 mg/mL 2-氯苯丙氨酸），漩渦振蕩混勻30 s，而后置于4 ℃離心機中，12 000 r/min離心15 min，取200 μL上清液待檢測。

色譜條件：分離色譜柱為C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；流速0.35 mL/min；流動相組成A：水+0.1%（體積分數(shù)，下同）甲酸溶液；B：乙腈+0.1%甲酸溶液；梯度洗脫條件：0～6 min，0～5% B，6～9 min，5%～50% B，9～13 min，50%～95% B，13～15 min，95% B；進樣量4 μL；自動進樣器溫度4 ℃。

質(zhì)譜條件：正離子模式：以氮氣作為霧化、錐孔氣；飛行管檢測模式V型；毛細管電壓4 kV，錐孔電壓35 kV，離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃，反向錐孔氣流速50 L/h，脫溶劑氣流速600 L/h，萃取錐孔電壓4 V。負離子模式：毛細管電壓3.5 kV，錐孔電壓50 kV，離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度300 ℃，反向錐孔氣流速50 L/h，脫溶劑氣流速700 L/h，萃取錐孔電壓4 V。離子掃描時間0.03 s，掃描時間間隔0.02 s，數(shù)據(jù)采集范圍m/z 50～1 000。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

抗氧化與行為學表征數(shù)據(jù)的結果用 ±s表示，并采用SPSS 11.5軟件中的ANOVA方法對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析，以P＜0.05為差異顯著。代謝組學數(shù)據(jù)利用Mass Profiler軟件對采集到的譜圖進行預處理，并在Excel軟件中進行后期編輯，將最終結果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，導入SIMCA-P 13.0軟件進行多元統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 原花青素B2對小鼠學習記憶能力的影響

2.1.1 對曠場行為學實驗的影響

表1 原花青素B2對小鼠曠場迷宮實驗的影響Table 1 Effect of procyanidin B2 on open test field of aging mice

如表1所示，與對照組（A）比較，模型組（B）小鼠的總路程和進入中心區(qū)域時間、次數(shù)、路程顯著減少（P＜0.05），表明D-半乳糖已經(jīng)引起小鼠的運動能力和探索能力下降，降低了小鼠的活動量。與模型組相比，原花青素B2組（C）小鼠中心區(qū)域時間延長、次數(shù)與路程顯著增加，表明原花青素B2可以改善衰老小鼠的運動能力和學習記憶能力。

2.1.2 對Y型迷宮行為學實驗的影響

表2 原花青素B2對小鼠Y型迷宮行為學實驗的影響Table 2 Effect of procyanidin B2on Y-maze behavior of aging mice

如表2所示，與模型組（B）相比，原花青素B2能顯著提高小鼠進入食物臂的次數(shù)并延長在食物臂停留的時間，降低衰老小鼠的錯誤次數(shù)，并且與對照組（A）處于同水平。這表明原花青素B2能抵御D-半乳糖導致的小鼠學習記憶能力的損傷。

2.1.3 對Morris水迷宮行為學實驗的影響

表3 原花青素B2對小鼠Morris水迷宮行為學實驗的影響Table 3 Effect of procyanidin B2 on water maze behavior of aging mice

對小鼠在Morris水迷宮探索平臺實驗中穿越逃生平臺的次數(shù)、逃生平臺所在象限的停留時間和路程進行了分析。由表3可知，與對照組（A）相比，模型組（B）穿越平臺的次數(shù)和路程顯著下降；相對于模型組，原花青素B2組（C）在次數(shù)和路程上顯著增加，且與對照組小鼠在穿越平臺的次數(shù)、逃生平臺所在象限的停留時間和路程無顯著差異（P＞0.05），這表明原花青素B2能夠增強衰老小鼠探索空間及空間定位的能力，提高其記憶力，延緩衰老。

2.2 原花青素B2對抗氧化指標的影響

表4 原花青素B2對小鼠抗氧化指標的影響Table 4 Effect of procyanidin B2 on antioxidant indices in aging mice U/mg pro

由表4可見，與對照組（A）相比，模型組（B）肝、腦、腎3 個組織中的T-AOC、SOD活力和GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05）（肝組織GSH-Px活力除外）。與模型組相比，原花青素B2組（C）小鼠組織中的T-AOC、SOD活力、GSH-Px活力顯著升高。表明原花青素B2可以提高衰老小鼠肝、腦、腎組織的抗氧化能力，清除體內(nèi)過多的自由基。如表5所示，模型組（B）小鼠組織中MDA含量與對照組（A）相比顯著增加（P＜0.05），表明衰老小鼠肝、腦、腎組織中有大量脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物積累。與模型組相比，原花青素B2組（C）小鼠MDA含量顯著低于模型組，原花青素B2能顯著抑制衰老小鼠肝、腦、腎等組織中MDA的產(chǎn)生，表明原花青素B2能夠抑制衰老小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，干預氧化損傷的產(chǎn)生。

表5 原花青素B2對小鼠MDA含量的影響Table 5 Effects of procyanidin B2 on MDA content in aging mice nmol/mg pro

2.3 血漿代謝組學研究

2.3.1 血漿樣本PLS-DA及模型驗證

圖1 血漿樣本的PLS-DA得分圖及排序驗證圖（負離子掃描模式）Fig. 1 PLS-DA score plot and permutation test of plasma samples(in negative ion mode)

如圖1所示，采用偏最小二乘法判別分析（partial least squares-discriminant，PLS-DA），以模型的擬合度（R2Y）和預測度（Q2）結合排序驗證圖共同提示對照組（A）與模型組（B）比較有顯著差異，且沒有過度擬合（R2Y＝0.997，Q2＝0.626）。模型組與原花青素B2組（C）顯著區(qū)分，存在顯著差異（R2Y＝0.992，Q2＝0.808），表明原花青素B2對D-半乳糖致衰老小鼠代謝輪廓有著顯著的影響。

2.3.2 差異代謝物的篩選及相關代謝通路研究結果

表6 主要差異性代謝物及其代謝通路Table 6 Major differential metabolites and their metabolic pathways

采用OPLS-PA模型的VIP值（閾值＞1）并結合t-檢驗的P值，尋找差異性表達代謝物，得到具有顯著性差異的潛在生物標志物（表6）。與對照組（A）相比，模型組（B）小鼠血漿中泛酸、肉堿、肌酸、檸檬酸、α-酮戊二酸含量降低，而溶血磷脂酰乙醇胺（0∶0/16∶0）、癸酸、馬尿酸含量上升。相比于模型組，原花青素B2組（C）小鼠血漿中存在12 種潛在生物標志物，其中磷脂酰膽堿（（O-18∶1（1E）/0∶0）、（P-18∶1（9Z）/0∶0）、（20∶5（5Z,8Z,11Z,14Z,17Z）/0∶0）、（O-12∶0/O-1∶0））、油酸、亞油酸、肉堿、牛黃膽酸、泛酸含量顯著升高，β-羥基丁酸、馬尿酸、丙酮酸這3 種物質(zhì)含量顯著降低。潛在的17 種生物標志物涉及了甘油磷脂代謝、不飽和脂肪酸合成、三羧酸循環(huán)、糖酵解、?；撬岷蛠喤；撬岽x、泛酸鹽和輔酶A合成等途徑，表明原花青素B2延緩衰老的作用機制可能與多種代謝通路相關，并且可能與代謝途徑相互聯(lián)系、相互影響。

3 討 論

本研究通過動物行為學表征與抗氧化表征評價了原花青素B2對D-半乳糖誘導衰老模型小鼠的干預作用，結果表明原花青素B2具有顯著干預D-半乳糖模型小鼠記憶減退與氧化損傷的作用。大腦的學習與記憶功能極易在衰老過程中受損[16]，D-半乳糖衰老模型引發(fā)小鼠學習與記憶損傷的機制可能是激活了體內(nèi)的醛糖還原酶和半乳糖氧化酶等途徑，產(chǎn)生大量活性氧，引起腦內(nèi)與學習記憶密切相關的膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶等蛋白質(zhì)氧化損傷，使乙酰膽堿合成減少，同時對神經(jīng)細胞核進行攻擊，上調(diào)半胱氨酸蛋白酶等凋亡基因表達，導致神經(jīng)元細胞凋亡，尤其是與學習記憶有關的膽堿能和谷氨酸能神經(jīng)纖維發(fā)生退變[17]。本研究中衰老小鼠的空間學習及記憶能力在原花青素B2干預后得到顯著改善，可能是由于原花青素B2具有多個酚羥基，能夠有效地清除活性氧，提高小鼠體內(nèi)的抗氧化能力，抑制凋亡基因的表達，抵御蛋白與脂質(zhì)氧化損傷，從而延緩衰老。

本研究進一步通過LC-Q-TOF-MS技術探究了原花青素B2對衰老小鼠內(nèi)源代謝物的影響，解析了其生物標志物，發(fā)現(xiàn)模型小鼠中三羧酸循環(huán)代謝通路發(fā)生顯著變化。三羧酸循環(huán)為組織細胞提供ATP，在此過程中的ATP是經(jīng)呼吸鏈產(chǎn)生的[18-21]，本研究結果顯示衰老模型小鼠血漿代謝產(chǎn)物中與三羧酸循環(huán)有關的檸檬酸與α-酮戊二酸含量均顯著降低；說明隨著機體的衰老，三羧酸循環(huán)中間代謝物含量降低，能量代謝水平也會受到影響。線粒體是機體進行氧化代謝的部位，是糖類、脂肪、氨基酸代謝釋放能量的場所[22]。線粒體的氧化損傷是細胞衰老和凋亡的基礎，可加速細胞老化，導致核DNA的氧化損傷，并影響基因轉(zhuǎn)錄。丙酮酸在線粒體中氧化脫羧生成乙酰輔酶A，是連接糖酵解和三羧酸循環(huán)的重要環(huán)節(jié)。原花青素B2干預使小鼠的T-AOC、SOD和GSH-Px活力明顯提高，血漿中泛酸含量顯著增加，丙酮酸含量降低，表明原花青素B2可能通過保護線粒體氧化損傷，促進丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，調(diào)節(jié)糖酵解、三羧酸循環(huán)趨于正常，從而延緩了衰老。

磷脂酰膽堿、不飽和脂肪酸不僅是脂代謝重要的相關物質(zhì)，而且與機體自由基的產(chǎn)生、氧化損傷等衰老和老化進程密切相關[23-25]。脂肪酸在脂酰輔酶A合成酶的催化下生成脂酰輔酶A，長鏈脂酰輔酶A通過肉堿進入線粒體才能代謝[24]。本實驗衰老模型小鼠血漿中肉堿的含量降低，從而抑制長鏈脂肪酸的氧化；而原花青素B2可清除體內(nèi)過多自由基，抑制活性氧與不飽和脂肪酸、磷脂等大分子反應，降低小鼠組織中MDA的含量，保護細胞膜的流動性和通透性，有利于脂酰輔酶A順利進入線粒體發(fā)生氧化反應，使肉堿含量升高、β-羥基丁酸含量降低，從而促進脂肪酸的β-氧化，并可能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂。原花青素B2干預后亞油酸、油酸含量顯著上升，抑制了脂質(zhì)過氧化，提示原花青素B2能夠通過抑制脂質(zhì)過氧化程度改善衰老小鼠的能量代謝異常。

磷脂酰膽堿也是構成生物細胞膜的主要成分[26-28]，腦神經(jīng)細胞中卵磷脂約占腦神經(jīng)細胞質(zhì)量的17%～20%[29]。大腦能直接從血液中攝取卵磷脂及膽堿，并很快轉(zhuǎn)化為乙酰膽堿，提高腦細胞的活性，從而減緩記憶力衰退的進程，改善腦功能[30-31]。有研究發(fā)現(xiàn)多烯磷脂酰膽堿從一定程度上可以減輕阿爾茨海默癥模型大鼠的行為學及形態(tài)學改變，減弱膠質(zhì)細胞活化的程度，并且對于突觸結構的完整性具有一定的保護作用[32-34]。模型小鼠在行為學中表現(xiàn)出記憶力減退、盲目尋找逃生途徑及對空間定位的記憶能力衰退的現(xiàn)象，原花青素B2干預組的小鼠血漿中磷脂酰膽堿（（O-18∶1（1E）/0∶0）、（P-18∶1（9Z）/0∶0）、（20∶5（5Z,8Z,11Z,14Z,17Z）/0∶0）、（O-12∶0/O-1∶0））含量顯著提高，磷脂合成的增加可促進神經(jīng)突起的生長，增加突觸和樹突觸的數(shù)量，促進大腦的學習記憶功能[35]。本研究發(fā)現(xiàn)原花青素B2干預組小鼠學習記憶能力和空間探索能力較模型組顯著提高，推測原花青素B2有顯著改善認知功能減退的作用。此外，苯丙氨酸濃度過高會造成神經(jīng)系統(tǒng)的損害，導致發(fā)育遲緩、學習記憶能力下降[31]，原花青素B2可能通過調(diào)節(jié)馬尿酸的水平，改善苯丙氨酸代謝，從而保護大腦功能，延緩其衰老。

本研究結果表明，原花青素B2的干預可顯著改善小鼠學習記憶減退與氧化損傷，且血漿代謝物與模型組差異顯著，表明其在一定程度上干預了機體代謝異常，從而延緩衰老進程。