支偉偉，蘇 哲，殷 強

1.西安市第三醫(yī)院心胸外科(西安 710018)，2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院(西安 710038)，3.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 (西安 710032)

主題詞 細(xì)胞增殖 基質(zhì)金屬蛋白酶2 基質(zhì)金屬蛋白酶9 @動脈迂曲 動物，實驗 大鼠

動脈迂曲是一種常見的異常血管形態(tài)[1-4]。最近的臨床研究表明，動脈迂曲與高血壓、衰老、動脈粥樣硬化、遺傳缺陷等多種疾病相關(guān)[5-7]。因此，動脈迂曲的發(fā)生及生物學(xué)效應(yīng)越來越受到關(guān)注。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)調(diào)節(jié)血管壁重構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2與纖維蛋白生成有關(guān)，而MMP-9與纖維蛋白溶解有關(guān)，MMP-2/9之間的動態(tài)平衡對于維持正常的血管形態(tài)具有重要的作用[8-9]。然而，MMP-2/9在動脈迂曲形成中發(fā)揮怎樣的作用尚不清楚。

材料與方法

1 動物材料及分組 本實驗選用SD大鼠16只，雌雄不拘，隨機分為對照組和動脈迂曲組，每組8只。對照組的大鼠左側(cè)頸動脈切斷后原位縫合；動脈迂曲組的大鼠參照文獻(xiàn)，大鼠右側(cè)頸動脈切取1 cm左右的動脈段，將動脈段端端吻合于左側(cè)頸動脈。大鼠均來源于第四軍醫(yī)大學(xué)動物所，且該研究符合第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物使用倫理審查。

2 手術(shù)方法 參照文獻(xiàn)進(jìn)行，簡述如下：動脈迂曲組大鼠，消毒鋪單。正中切開大鼠頸部2～3 cm切口，顯露并游離左側(cè)頸總動脈，切取1 cm動脈段，放入生理鹽水中備用。然后，顯露游離右側(cè)頸總動脈，切斷頸總動脈。將左側(cè)頸動脈段端端吻合于右側(cè)頸總動脈。血管吻合采用間斷縫合方式，一般縫合6～8針，手術(shù)結(jié)束后絲線閉合切口。對照組大鼠將左右兩側(cè)頸動脈分別切斷后原位縫合，其余同實驗組。術(shù)后對大鼠進(jìn)行常規(guī)食物和水飼養(yǎng)1周。

術(shù)后1周取出移植動脈段。動脈段取出前24 h，行尾靜脈注射BrdU(50 mg / kg)，標(biāo)記新增殖的細(xì)胞。動脈段取出后用2%多聚甲醛(PFA，Sigma公司)固定過夜。并進(jìn)行HE染色與免疫組化分析，檢查細(xì)胞增殖與調(diào)控胞外基質(zhì)重塑的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9水平，對血管壁重塑進(jìn)行評估。

3 BrdU染色 參照文獻(xiàn)檢測細(xì)胞增殖，簡述步驟如下：切片(5 μm厚度)脫蠟后用10mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(Thermos Fisher 公司)煮沸。隨后用0.5%的Triton X-100(Sigma公司)進(jìn)行通透性處理，用10%的FCS-PBS封閉后于室溫放置30～60 min。滴加抗鼠BrdU抗體(10%的FCS-PBS按1∶15稀釋)并在37 ℃條件下孵育1 h。用PBS洗滌后，滴加抗鼠二抗(1%的FCS-PBS按1∶20稀釋)并于 37 ℃條件下孵育1 h，同樣用PBS洗滌。隨后將切片用1 μg/ ml濃度的Hoechst 33258(Sigma公司)于37 ℃下復(fù)染30 min。

用熒光顯微鏡對細(xì)胞增殖進(jìn)行觀察，每個樣品選取5個視野，分別用ImagePro對各個視野中BrdU陽性細(xì)胞和細(xì)胞核復(fù)染陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。依據(jù)BrdU陽性細(xì)胞占總細(xì)胞百分比對各視野細(xì)胞增殖率進(jìn)行計算，取5個視野的均值為各樣本細(xì)胞增殖率。

4 MMP-2和MMP-9的免疫組織染色 除所用一抗為鼠抗MMP-2及所用二抗體為Cy3標(biāo)記羊抗鼠(Jackson immuores earch lab，PA)抗體外，MMP-2免疫組化染色程序與BrdU染色相同。每個樣本同樣選取5個視野進(jìn)行拍照，所有拍照均采用5.31 s的曝光時間，用ImagePro對MMP-2表達(dá)的綜合最佳密度(IOD)進(jìn)行分析。除一抗為抗兔MMP-9，二抗為Cy3標(biāo)記驢抗兔(Jackson immuo rese arch lab，PA)抗體外，MMP-9染色與分析流程與MMP-2相同[10-13]。

5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件，所有實驗數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，用2-way ANOVA并結(jié)合Tukey的事后分析(JMP，SAS Institute Inc)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞增殖 動脈迂曲組在1周時與對照組相比，細(xì)胞增殖顯著增加[動脈迂曲組(13.2±6.8)%，對照組(2.43±2.3)%](P<0.001，圖1)。但發(fā)生彎曲的移植物內(nèi)側(cè)[(14.6±7.7)%]和外側(cè)[(13.3±4.0)%]細(xì)胞增殖無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

2 MMP-2和MMP-9 與對照組相比，動脈迂曲組MMP-2的表達(dá)在第1周顯著升高了4.2倍(P<0.001)，但MMP-9表達(dá)未發(fā)生顯著增加(P= 0.63,圖2)。

注：與對照組相比，*P<0.05

圖1 移植物中細(xì)胞增殖檢測

注：與對照組相比，* P<0.05

圖2 移植物中的基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和-9(MMP-9)水平分析

討 論

動脈迂曲是一種常見的異常血管形態(tài)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，動脈迂曲與高血壓、動脈粥樣硬化等密切相關(guān)。雖然針對動脈迂曲的研究較多，但是大部分局限于外科的解剖結(jié)構(gòu)性的觀察，對于動脈迂曲的發(fā)生機制目前尚不清楚[11-12]。

本實驗結(jié)果顯示血管屈曲模型在術(shù)后建立1周后，MMP-2表達(dá)和細(xì)胞增殖顯著增加，這很可能是由于動脈彎曲引起的管壁應(yīng)力和剪切應(yīng)力改變所致。剪切應(yīng)力和管壁應(yīng)力可通過調(diào)控細(xì)胞增殖[13- 14]、凋亡[15]、粘附[16]和血小板聚集[17]。然而，術(shù)后1周MMP-9在屈曲動脈中的表達(dá)與對照組無明顯差異，表明血管外側(cè)未發(fā)生重塑[18]。

由于預(yù)算限制，本項目存在樣本量小的不足。觀察持續(xù)時間短是本項目的另一缺陷，彎曲的動脈可能需要更長的時間來適應(yīng)并變得永久曲折。盡管存在上述不足，本研究仍成功構(gòu)建了體內(nèi)動脈彎曲模型，并對其在研究動脈壁重塑中的可行性進(jìn)行了評估，彎曲動脈的長期適應(yīng)性將是未來我們研究的重點。此外，該模型有望改造為靜脈移植模型并用以靜脈屈曲重塑研究。

總之，從左到右的大鼠頸動脈移植是研究屈曲動脈壁重塑的良好動物模型。MMP-2相關(guān)研究有望闡明動脈屈曲的發(fā)展過程與機制。