董文江，胡榮鎖，宗 迎，龍宇宙，趙建平

（1中國熱帶農業(yè)科學院香料飲料研究所，海南萬寧571533；2國家重要熱帶作物工程技術研究中心，海南萬寧571533；3海南省熱帶香料飲料作物工程技術研究中心，海南萬寧571533）

0 引言

咖啡原產于埃塞俄比亞，與可可、茶葉并稱世界三大飲料，其產量、產值和消費量均居三大飲料作物之首，在國際貿易中是僅次于石油的第二大原料型產品，香氣被認為是咖啡最重要的屬性之一[1-2]。在咖啡植物品種中‘阿拉比卡’（即小粒種咖啡）已被報道為最具芳香氣味的品種，它通常用于生產卓越品質的沖泡咖啡。中國咖啡的主產區(qū)位于海南和云南地區(qū)，其中98%的咖啡出自云南[3]。云南熱區(qū)的自然條件與世界上質量最好的咖啡產地——哥倫比亞十分相似，即低緯度、高海拔、晝夜溫差大。云南種植的主要是小?？Х?，具有濃而不苦、香而不烈、略帶果酸味的特點，可與世界上最好的藍山咖啡媲美，曾被國際咖啡組織(International coffee organization，ICO)評為一類產品[4-6]。

生咖啡豆中的化學組分由于烘焙發(fā)生一系列反應（如美拉德和焦糖化反應等）才能形成咖啡特有的風味，而生咖啡豆中揮發(fā)性成分較少。目前，國外科學工作者已經鑒定出生咖啡豆中絕大部分的揮發(fā)性物質，并對咖啡的特征香氣物質進行了研究。Toci等[7]采用HS-SPME/GC-MS對巴西生咖啡豆中的揮發(fā)性物質進行分析，共鑒定出43種揮發(fā)性物質；Franca等[8-10]研究了生咖啡豆中風味前體物質（葫蘆巴堿、綠原酸、咖啡因、蔗糖、蛋白質等）的含量與咖啡風味品質之間的關系。近年來，國內對小粒咖啡的研究多為復合栽培、病蟲害防控以及烘焙特性方面，對于云南主產區(qū)生咖啡豆的揮發(fā)性成分研究未見報道。張豐等[11]對云南不同地區(qū)3個烘焙度的烘焙豆揮發(fā)性成分進行了研究，檢測出65種揮發(fā)性成分，其中呋喃類物質相對含量最高，PCA和HCA可用來區(qū)分不同地區(qū)烘焙咖啡，酸類物質可作為區(qū)分普洱同保山、臨滄地區(qū)樣品的判別指標，吡嗪類、呋喃類和酮類與臨滄地區(qū)樣品相關性較高，與保山地區(qū)樣品相關性較高物質主要為吡啶類。烘焙豆與生豆的揮發(fā)性成分有差異，生豆中的揮發(fā)性成分通過烘焙過程中的美拉德反應、焦糖化反應等會轉化為烘焙豆的芳香物質，筆者在其研究基礎上進一步補充完善。同一品種的‘阿拉比卡’樣品在不同產區(qū)的品質差異顯著，由于咖啡種植具有較強的地域性，種植模式、氣候條件、海拔高度對咖啡香氣影響較大[12]。

咖啡為中國云南地區(qū)的高原優(yōu)勢特色資源，不同主產區(qū)特殊的地理環(huán)境導致其風味成分不同，進而影響產品的風味品質和商業(yè)價值，因此有必要對不同地區(qū)生咖啡豆樣品中揮發(fā)性成分進行分析。筆者以云南保山(BS)、德宏(DH)、臨滄(LC)和普洱(PE)4個主產區(qū)生咖啡豆為試材，采用HS-SPME/GC-MS對揮發(fā)性成分進行分析，利用系統(tǒng)聚類分析和主成分分析統(tǒng)計學方法對樣品進行區(qū)分，尋找對不同地區(qū)生咖啡豆品質影響較大的特征化合物，旨在為云南地區(qū)咖啡豆的風味品質提升及產地追溯提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 生咖啡豆來源于云南省4個咖啡主產區(qū)，包括保山咖啡（云南保山佐園咖啡莊園，BS，編號：1～3號）、德宏咖啡（云南德宏熱帶農業(yè)科學研究所，DH，編號：4～6號）、臨滄咖啡（云南臨滄凌豐咖啡產業(yè)有限公司鎮(zhèn)康分公司，LC，編號：7～9號）、普洱咖啡（云南普洱曼老江農業(yè)開發(fā)有限公司，PE，編號：10～12號）。濕法加工處理得到生咖啡豆。C7～C30正構烷烴標準品（純度99.5%；美國Sigma公司）

1.1.2 儀器 VTA6S3型咖啡粉碎機，德國MAHLKONIG儀器公司；Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；固相微萃取裝置和萃取頭(75 μm CAR/PDMS)，美國Supelco公司

1.2 試驗方法

1.2.1 HS-SPME萃取法 固相微萃取頭插入在氣相色譜儀進樣口老化，溫度為300℃，老化時間為1 h，備用；精確稱量1.5 g生咖啡豆粉末樣品（過40目篩）于20 mL采樣瓶中，加蓋密封，置于恒溫水浴鍋中預熱20 min。將萃取頭插入采樣瓶中吸附30 min，取出，插入250℃的GC-MS進樣口解吸3 min。

1.2.2 氣相色譜-質譜(GC-MS)測定[13]

（1）色譜條件。DB-WAX色譜柱(30 m×0.25 mm× 0.25 μm)；載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min，不分流進樣，時間為3 min。程序升溫40℃保持2 min后以1.5℃/min升至130℃，之后以4℃/min升至200℃，保持5 min；檢測器溫度(EI)為230℃，進樣口溫度為250℃。

（2）質譜條件。電噴霧離子源，其中離子源溫度、接口溫度、電子能量和掃描范圍(m/z)分別為230℃、250℃、70 eV和35～350 amu。

1.2.3 生咖啡豆中揮發(fā)性物質的定性和定量分析

（1）定性。采用GC-MS的NIST08譜庫，結合匹配度(＞85%)以及參考文獻對生咖啡豆中揮發(fā)性物質進行定性分析。

（2）定量。根據總離子流圖檢索NIST08譜庫結合參考文獻分析咖啡生豆揮發(fā)性特征組成，應用峰面積歸一化法計算組分相對百分含量。

1.2.4 統(tǒng)計學分析

（1）主成分分析(principal component analysis，PCA)是將多個變量通過線性變換，利用數(shù)據降維，線性組合得到前幾個主要變量的一種多元統(tǒng)計分析方法。采用SPSS 20.0提供的主成分分析法，將數(shù)據進行標準化處理，做因子分析，得到主成分的方差貢獻表，選擇主成分個數(shù)(PC)[14]。求出不同變量相應的主成分特征向量，特征向量和標準化數(shù)據乘積即變量的主成分負荷量，然后求出該樣品的主成分得分對樣品的特性進行推斷和評價。

（2）系統(tǒng)聚類分析(hierarchical cluster analysis，HCA)是研究樣品分類常用的一種多元統(tǒng)計分析方法，用于評價不同類別樣品間的差異以及樣品間的聚類分布和親緣關系。在本研究中，原始數(shù)據先經過歸一化后再輸入至系統(tǒng)平臺運算，利用SPSS 20.0軟件提供的系統(tǒng)聚類法，計算出歐式距離，畫出樹狀圖，依此來判斷各地區(qū)樣品的親緣關系遠近，并與PCA的分類結果進行對比。

2 結果與分析

2.1 4個地區(qū)生咖啡豆揮發(fā)性成分及相對含量的比較

利用上述的HS-SPME條件結合GC-MS對云南不同地區(qū)生咖啡豆揮發(fā)性物質進行分析。通過與NIST08標準譜庫對照，結合相關文獻報道，共鑒定出42種揮發(fā)性物質，主要為酸類、酮類、醇類、碳氫類、酯類、醛類等幾類化合物，該結果與文獻報道一致[15-18]。不同地區(qū)生咖啡豆揮發(fā)性成分的總離子流圖如圖1所示。從圖1可看出，德宏(DH)地區(qū)中峰的個數(shù)和強度都要大于其他3個地區(qū)，其次是保山(BS)地區(qū)，臨滄(LC)和普洱(PE)地區(qū)中峰的個數(shù)較少，即揮發(fā)性成分相對較少。

圖1 云南不同地區(qū)生咖啡豆的GC-MS總離子流圖

對各成分進行定性定量分析，利用GC-MS自帶的NIST08譜圖庫檢索，共鑒定出42種揮發(fā)性成分，采用峰面積百分歸一化法對各成分進行定量分析。色譜峰對應的揮發(fā)性物質及各類化合物含量對比如表1和圖2所示。表中結果顯示，共分離鑒定出42種揮發(fā)性物質，其中酸類8種、酮類3種、醇類10種、碳氫類2種、酯類5種、醛類2種、吡嗪類5種、含硫化合物4種、酚類2種以及吡啶類1種化合物。在保山(BS)、德宏(DH)、臨

滄(LC)和普洱(PE)4個地區(qū)的生咖啡豆中在檢測限范圍內共匹配出7種共有揮發(fā)性成分，分別是3-甲基丁酸(28.11%)、乙醛(7.31%)、乙酸甲酯(2.08%)、2-羥基-2-甲基苯甲酸甲酯(5.31%)、丙醇(8.99%)、1-丁醇(0.91%)和苯甲醇(2.33%)。

表1 不同地區(qū)生咖啡豆的揮發(fā)性成分及其相對含量

從4個地區(qū)樣品中分別鑒定出22種、36種、13種和14種揮發(fā)性成分，其中，酸類物質會影響咖啡風味口感，德宏地區(qū)種類最多且含量也最高，臨滄和普洱地區(qū)含量接近，都非常少[19]，在不同地區(qū)的相對含量排序是PE＞BS＞DH＞LC，普洱地區(qū)咖啡中酸類物質含量高達54.581%；酮類物質會產生青草香氣，其相對含量排序是LC＞BS＞PE＞DH，臨滄地區(qū)咖啡中酮類含量占總量一半，而德宏地區(qū)咖啡中未檢測出酮類物質；醇類物質的相對含量都比較少，但是檢測出的種類較多，其中丙醇、1-丁醇和苯甲醇3種物質為共有物質，丙醇含量較高；酯類物質的相對含量排序是BS＞LC＞PE＞DH；醛類物質在烘焙后會大量產生，生豆中乙醛含量較多，德宏和普洱地區(qū)含量相似，保山地區(qū)最少；吡嗪類物質是具有較強氣味的芳香類化合物，在烘焙后表現(xiàn)為烘烤味和泥土味[20]，德宏地區(qū)含量最高，而普洱地區(qū)未檢測到；含硫化合物的含量雖然不多卻對咖啡風味形成起重要作用，其中2-糠基硫醇具有烘烤味和肉湯味，在高溫下容易形成[21]，德宏地區(qū)含量最高，其他地區(qū)含量相似；酚類物質中的4-乙烯基愈創(chuàng)木酚具有丁香味和香辛料氣味，愈創(chuàng)木酚具有塑料味和煙熏味[22]，兩者含量均較低，前者只在保山地區(qū)檢測得到，后者只在德宏地區(qū)檢測得到；吡啶類物質只在德宏地區(qū)檢測得到且含量非常少，其在烘焙后會產生焦糊味和餅干風味[23]。

續(xù)表1

圖2 不同地區(qū)樣品中揮發(fā)性物質含量對比圖

2.2 生咖啡豆的主成分分析

以12個樣本的10類揮發(fā)性物質相對含量構成12×10矩陣，采用SPSS 20.0數(shù)據處理系統(tǒng)解出的主成分全部方差解析表2和主成分因子得分表3。從表2可以看出，當提取主要因子達到2時，方差貢獻率77.99%，前2個因子可反映大部分樣品原始信息。

表2 PCA的全部方差解析表

表3 PCA的特征向量和載荷表

從表2中可看出，PC1的方差貢獻率為48.247%，PC2的方差貢獻率為29.747%，且前2個PC的累計方差貢獻率為77.994%，表明前2個主成分可解釋原始數(shù)據的大部分信息，故選擇前2個PC用于后續(xù)統(tǒng)計分析。由表3可知，提取出10種主要成分，第一主成分[式(1)]主要反映吡嗪類、酸類、醛類和碳氫類的信息；第二主成分[式(2)]用于表示醇類和酚類物質的原始信息。不同地區(qū)樣品與揮發(fā)性成分的相關性可根據載荷的相對位置來判斷，載荷為矢量，既有大小又有方向，距離樣品越近、在PC1和PC2方向上值越大，則與樣品的相關性越大。載荷用于解釋各變量與PC間的相關性大小見表3，PC1與吡嗪類和酸類物質相關性最大，醛類和碳氫類物質次之，而與含硫化合物、酮類、醇類和酯類物質呈負相關性；PC2與醇類和酚類物質相關性最大，酸類和吡嗪類物質次之，與酮類、碳氫類、酯類和含硫化合物負相關。綜合分析各成分作用大小，酸類、酮類、醇類和碳氫類是4個地區(qū)生咖啡豆的主要揮發(fā)性物質。由表3～4可知，與保山地區(qū)相關性較高的有酮類和醛類，德宏地區(qū)的有醇類、酯類和酚類，臨滄地區(qū)的有酸類、吡嗪類和碳氫類，普洱地區(qū)的有吡啶類和含硫化合物。從而，可以用揮發(fā)性物質作為區(qū)分4個地區(qū)生咖啡豆的參照。

表4 主成分因子分析

圖3是以第一主成分為縱坐標，第二主成分為橫坐標獲得的生咖啡豆主成分二維散點圖，10種揮發(fā)性成分分為3類，第1類有酸類、醇類、酯類、酚類、吡嗪類和碳氫類，第2類有吡啶類和含硫化合物，第3類有酮類和醛類。2個主成分即可反映生咖啡豆揮發(fā)性物質的基本特征。圖4是以前2個主成分為x軸和y軸獲得的不同地區(qū)主成分分析二維散點圖，每個地區(qū)的樣品各自聚為一類，其中德宏地區(qū)樣品位于第一象限，保山地區(qū)樣品位于第二象限，普洱地區(qū)樣品位于第三象限，臨滄地區(qū)樣品位于第四象限，4個地區(qū)的樣品分別位于不同象限，各自聚為一類，說明主成分分析能夠反映不同地區(qū)生咖啡豆的基本特性。

圖3 生咖啡豆的PCA二維載荷投影圖

圖4 生咖啡豆的PCA二維得分投影圖

2.3 不同地區(qū)生咖啡豆的系統(tǒng)聚類分析

將表1的數(shù)據進行標準化處理，利用SPSS 20.0軟件對標準化后的數(shù)據矩陣進行聚類分析，構建4個地區(qū)樣品間的親緣關系樹狀圖，圖5是以揮發(fā)性物質數(shù)據矩陣（12個樣品×10個變量）為輸入變量的聚類分析樹狀圖。

從圖5中可看出，BS、DH、LC、PE 4個地區(qū)樣品間歐式距離較短，BS和LC地區(qū)樣品距離最近，PE和DH地區(qū)樣品距離較近，DH和LC地區(qū)樣品距離較遠，PE和LC地區(qū)樣品距離最遠，但每個地區(qū)之間親緣關系不是很近，按各自特性分別聚為一類，當歐式距離為1.0時即可將4個地區(qū)樣品完全區(qū)分開，這與PCA分析結果一致，表明可用此方法鑒別不同地區(qū)的生咖啡豆。

3 結論

（1）采用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯(lián)用(HSSPME/GC-MS)技術對云南4個地區(qū)（保山、德宏、臨滄和普洱）生咖啡豆的揮發(fā)性成分進行了分析，共分離鑒定出45種香氣物質，4個地區(qū)依次鑒定出23種、37種、13種和14種揮發(fā)性成分，其中呋喃類7種、酮類3種、醇類9種、碳氫類2種、酯類5種、醛類2種、吡嗪類5種、酸類5種、含硫化合物4種、酚類2種、吡啶類1種。其中保山地區(qū)的醇類和酯類相對含量較高，德宏地區(qū)的碳氫類、酸類、吡嗪類和含硫化合物相對含量較高，臨滄地區(qū)的酮類和醛類相對含量較高，普洱地區(qū)的呋喃類相對含量較高。4個地區(qū)共有成分有7種，分別為3-甲基丁酸、乙醛、乙酸甲酯、2-羥基-2-甲基苯甲酸甲酯、丙醇、1-丁醇和苯甲醇，占總揮發(fā)性物質的54.86%。

圖5 以揮發(fā)性成分數(shù)據矩陣為輸入變量的聚類分析樹狀圖

（2）PCA的第一主成分貢獻率為48.247%，第二主成分貢獻率為29.747%，前2個主成分可以反映不同地區(qū)生咖啡豆的主要揮發(fā)性物質，還可以利用揮發(fā)性物質區(qū)分不同地區(qū)的生咖啡豆。酮類和醛類物質可作為區(qū)分保山和其他3個地區(qū)的判斷指標，醇類、酯類和酚類物質可作為區(qū)分德宏和其他3個地區(qū)的判斷指標，酸類、吡嗪類和碳氫類物質與臨滄地區(qū)樣品相關性較高，吡啶類和含硫化合物與臨滄地區(qū)樣品相關性較高。

（3）HCA的樹狀圖顯示4個地區(qū)生咖啡豆可以各自聚為一類，4個地區(qū)的親緣距離都較遠，這與PCA的分析結果一致。通過對云南不同地區(qū)生咖啡豆的揮發(fā)性物質分析，建立揮發(fā)性物質和地區(qū)的相關性，根據揮發(fā)性物質的差異為判斷指標可以很好地區(qū)分云南不同地區(qū)咖啡豆，為云南咖啡的風味品質提升及產地追溯提供理論依據。

4 討論

生咖啡豆中揮發(fā)性成分對于烘焙咖啡產品的香氣形成至關重要，它們既包括咖啡生長過程中形成的成分，亦受采后加工過程中如脫膠、干燥及貯藏等過程影響。揮發(fā)性成分已被廣泛用于咖啡豆的地理來源鑒別、品質好壞區(qū)分以及脫膠過程中微生物對咖啡質量調控等方面，國內外對于云南不同產區(qū)生咖啡豆中揮發(fā)性成分的研究還未見報道。張豐等[11]通過HSSMPE/GC-MS對云南3個地區(qū)（普洱、保山、臨滄）烘焙豆中揮發(fā)性物質分析，結果表明，呋喃類物質含量最高，不同地區(qū)樣品可區(qū)分開。董文江等[24]對云南不同地區(qū)生咖啡豆風味前體物質研究表明，普洱咖啡中脂肪酸和其他地區(qū)均呈顯著性差異(P＜0.05)；保山咖啡中氨基酸同其他地區(qū)均呈顯著性差異；而臨滄咖啡中單糖、蛋白質、脂肪和保山咖啡均呈顯著性差異。Bertrand等[15]考察了氣候和地理環(huán)境因素對留尼旺島阿拉比卡生豆中揮發(fā)性成分和咖啡液質量的影響，酸度、果香和風味與低氣溫環(huán)境密切相關，而高氣溫環(huán)境增加醇類物質的積累，海拔高度和平均氣溫對咖啡質量影響顯著。本研究中通過化學計量學方法結合HSSPME/GC-MS可推測中生咖啡豆中與各地區(qū)相關性較大的成分。

Lee等[25]通過微生物調控生咖啡豆脫膠過程中發(fā)酵過程，改變生豆中揮發(fā)性成分及其他反應前體物如脯氨酸和天冬氨酸含量增加1.5倍，阿魏酸和咖啡酸的大量降解導致?lián)]發(fā)性風味化合物濃度增加2倍以上。Saw等[26]研究東南亞地區(qū)阿拉比卡、利比里亞和羅布斯塔生豆中揮發(fā)性成分，3類樣品中揮發(fā)性成分組成極為相似，均具有較高含量的酚類物質，主要為p-乙烯基愈創(chuàng)木酚和羧酸，同時評價其抗氧化特性。因此，生豆中揮發(fā)性成分對咖啡最終產品的質量至關重要，后續(xù)研究可進一步通過相關性分析建立云南小粒種生咖啡豆中揮發(fā)性成分與烘焙豆杯測得分、電子感官得分及物化指標間的相關性模型，更加客觀真實地評價特定產區(qū)原料對最終產品風味品質的影響，對于云南地區(qū)咖啡豆質量提升和產地追溯具有指導意義。