曹玉凈，呂秋霞

(河南省中醫(yī)院1.創(chuàng)傷骨科;2.風(fēng)濕骨病科，河南鄭州450002)

骨折修復(fù)過程與機(jī)體多種細(xì)胞因子及組織之間協(xié)同作用密切相關(guān)。血管生成與骨生成關(guān)系緊密相連，尤其在骨修復(fù)過程中尤為重要［1］。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促進(jìn)血管生成的直接誘導(dǎo)因子，可出現(xiàn)于骨折愈合過程，特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和血管生成，并可增加血管通透性［2］。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF/CCN2)屬CCN 家族，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞分裂，參與血管生成和創(chuàng)傷愈合等重要過程［3］，但在骨形成和骨折愈合中作用尚不清楚。本實驗探討VEGF 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中CCN2 對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，為骨形成和骨折愈合的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)(Promocell公司)，人成骨細(xì)胞(osteoblast)(天津衛(wèi)凱生物工程有限公司)，由本實驗室保存。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和DMSO(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，ELISA 試劑盒(Bio Tek 公司)，CCN2 抗體和對照抗體IgG(Santa Cruz 公司);VEGF165 (Abnova 公司)。

1.2 成骨細(xì)胞上清液的制備

成骨細(xì)胞接種至6 孔板中，PBS 洗滌1 次，換成不含血清的DMEM 培養(yǎng)12 h。PBS 洗滌，加入含有0.2%胎牛血清的DMEM，20 ng/mL VEGF 刺激，1 h后，更換含有0.2%胎牛血清DMEM。培養(yǎng)6 h 后收集細(xì)胞上層清液用于遷移實驗和血管生成實驗。同時制備未加VEGF 刺激的成骨細(xì)胞作為對照組。

1.3 CCN2 基因siRNA 序列的設(shè)計及轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞

siRNA 片段由上海生工合成。靶向CCN2 的siRNA 序列為5'-AATGTTCTCTTCCAGGTCAGCCCT GTCTC-3'(正義鏈)和5'-AAGCTGACCTGGAAGA GAACACCTGTCTC-3'(反義鏈)。制備終濃度為80 nmol/L的siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，實驗組加入CCN2-siRNA 混合物，同時設(shè)置空白對照組(control)。將人成骨細(xì)胞以2 ×105個/孔接種于6 孔板，待細(xì)胞增殖至70%～80%匯合時，更換無血清培養(yǎng)基，采用LipofetamineTM2000 將CCN2-siRNA 轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞，每組實驗重復(fù)3 次。

1.4 Real time PCR 法檢測成骨細(xì)胞CCN2 mRNA 的表達(dá)

用RNAiso plus kit 試劑盒提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒要求操作。CCN2 上游引物序列:5'-GC AGGCTAGAGAAGCAGAGC-3'，下游引物序列:5'-AT GTCTTCATGCTGGTGCAG-3'［4］，檢測按實驗室常規(guī)方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。定量PCR 采用的體系為:dNTPs 2 μL，10 ×緩沖液5 μL，上下游引物各10 皮摩爾，模板2 μL，加三蒸水至總體積50 μL;擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94 ℃5 min，進(jìn)入循環(huán)，變性94 ℃1 min，退火60 ℃1 min，延伸72 ℃3 min，30 個循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。以β-actin 為內(nèi)參，依據(jù)2-ΔΔCT法分析相對基因表達(dá)水平，上述實驗重復(fù)3 次。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測成骨細(xì)胞CCN2 含量

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測成骨細(xì)胞CCN2的含量，按說明書嚴(yán)格操作，每個實驗重復(fù)3 次。

1.6 Transwell 法檢測細(xì)胞遷移

參照文獻(xiàn)［5］方法進(jìn)行，取直徑為6.5 mm、孔徑為8.0 μm 的聚碳酯膜分離上、下兩室的24 孔Transwell小室。實驗前，聚碳酯膜上涂有PBS(含有10 μg/mL 纖連蛋白)4 ℃放置16 h。消化內(nèi)皮細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，(用PBS 洗1～2遍)，用含2%胎牛血清的DHEM 培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1 ×106/mL。取細(xì)胞懸液100 μL 加入Transwell 小室，相應(yīng)的刺激因素加入到下室，各設(shè)4個復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)6 h 后，顯微鏡下計數(shù)。

1.7 Matrigel 實驗檢測管樣結(jié)構(gòu)的形成能力

每孔100 μL 基質(zhì)膠均勻鋪于48 孔培養(yǎng)板的底部，靜置于37 ℃孵箱1 h，使基質(zhì)膠凝固。消化、離心和重懸對數(shù)增殖期細(xì)胞，使重懸后的細(xì)胞濃度為5 ×105個/mL，細(xì)胞懸液以100 μL/孔加入基質(zhì)膠已凝固的48 孔培養(yǎng)板中，將100 μL 含有無血清DMEM 加到對照組，實驗組加入相應(yīng)的成骨細(xì)胞上清液，每組設(shè)3 個復(fù)孔。48 h 于倒置顯微鏡下觀察是否有管樣結(jié)構(gòu)形成，并測量已形成的管樣結(jié)構(gòu)長度，上述實驗重復(fù)3 次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，試驗結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(±s)表示，采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 VEGF 增加成骨細(xì)胞中CCN2 mRNA 的表達(dá)

VEGF 刺激12 h 后，成骨細(xì)胞中CCN2 mNRA 表達(dá)及蛋白含量均上調(diào)(P＜0.05，圖1)。VEGF 呈時間和劑量依賴性上調(diào)成骨細(xì)胞中CCN2 表達(dá)(圖2)。

圖1 VEGF 作用12 h 后誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中CCN2 的表達(dá)Fig 1 After treatment for 12 hours，VEGF induces the expression of CCN2 in osteoblasts(±s，n=3)

圖2 VEGF 呈劑量和時間依賴性誘導(dǎo)CCN2 mRNA 表達(dá)Fig 2 VEGF induces CCN2 expression in a dose-and time-dependent manner(n=3)

2.2 成骨細(xì)胞產(chǎn)生的CCN2 可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移

PC 組與正常對照組相比對內(nèi)皮細(xì)胞遷移有明顯的促進(jìn)作用(P＜0.05)(圖3)。加入抗CCN2 后，遷移明顯降低(P＜0.05)(圖3)。

圖3 成骨細(xì)胞產(chǎn)生的CCN2 可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移Fig 3 Osteoblast-derived CCN2 promotes HUVEC migration (n=3)

與對照組相比，CCN2-siRNA 組CCN2 表達(dá)水平明顯下調(diào)(P＜0.05，圖4A)。沉默CCN2 后內(nèi)皮細(xì)胞遷移情況(圖4B):VEGF-OSE 組:CCN2-siRNA 組內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力較con-siRNA 組和PC 組明顯降低(P＜0.05)。

2.3 成骨細(xì)胞中的CCN2 對內(nèi)皮細(xì)胞體外成管的影響

VEGF-OSE 組:PC 組較正常對照組管樣長度明顯增加(P＜0.05)。VEGF-OSE 組，anti-CCN2 組較PC 組管樣長度明顯降低(P＜0.05)，con-IgG 組與PC 組比較無明顯差別。OSE 組，3 組內(nèi)皮細(xì)胞管樣長度較正常對照組相比均無顯著變化(圖5)。

3 討論

血管生成(angiogenesis)是骨折修復(fù)過程中的重要因素，它不僅對骨折部位提供營養(yǎng)，而且參與了骨折的修復(fù)過程［6］。VEGF 是目前已知的血管生成的重要介質(zhì)之一，它可誘導(dǎo)血管生成，促進(jìn)骨折愈合［7］。VEGF 還通過與其他生長因子相互作用來影響骨生長和修復(fù)過程。CCN2 是細(xì)胞功能和血管生成的重要調(diào)節(jié)分子，它可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移、存活和黏附［8］。CCN2 還通過參與整合素αvβ3 介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、誘導(dǎo)血管生成、促進(jìn)游走、提高生長因子誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖［9］。CCN2 促進(jìn)血管生成有利組織修復(fù)和骨折愈合。

本研究通過體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞和HUVEC，觀察到VEGF 刺激成骨細(xì)胞后，CCN2 表達(dá)明顯上調(diào);成骨細(xì)胞產(chǎn)生的CCN2 增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成等促血管生成能力。表明成骨細(xì)胞產(chǎn)生的CCN2 參與了內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成，提示成骨細(xì)胞產(chǎn)生的CCN2 在內(nèi)皮細(xì)胞血管生成和骨折愈合中可能發(fā)揮重要作用。本文為骨血管形成中成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)系提供了一些依據(jù)，成骨細(xì)胞產(chǎn)生的CCN2 可以成為骨折愈合治療的一個新靶點(diǎn)。

圖4 CCN2-siRNA 對內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響Fig 4 Effect of CCN2-siRNA on HUVEC migration(n=3)

圖5 成骨細(xì)胞產(chǎn)生的CCN2 對內(nèi)皮細(xì)胞體外成管的影響Fig 5 Effect of osteoblast-derived CCN2 on capillary tube formation in vitro(n=3)

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