2，

(1.山東省口腔組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250012；2.山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012；3.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，山東 泰安 271000；4.泰山醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000)

牙槽骨的骨量及位點(diǎn)保存是種植義齒修復(fù)最為關(guān)鍵的工作，如何預(yù)防拔牙后牙槽嵴吸收，保證拔牙后有足夠的骨量來(lái)進(jìn)行種植牙尤為重要[1]。而且拔牙術(shù)后牙槽窩骨愈合較慢，嚴(yán)重影響患者對(duì)美觀及早期功能恢復(fù)的要求。因而，探索一種簡(jiǎn)便操作，可有效減少骨吸收，縮短修復(fù)等待時(shí)間的方法極為迫切。膠原蛋白海綿有良好的生物相容性、較強(qiáng)的止血效果及吸附功能，便于局部沉積鈣離子和磷酸根離子，能為拔牙后骨腔的血塊凝集提供足夠的立體空間，可有效地促進(jìn)成骨。目前臨床中普遍采用膠原蛋白海綿填塞頜骨囊腫手術(shù)后的骨腔及埋伏牙骨腔取得良好的止血效果，同時(shí)囊腔成骨速度也明顯提高[2]。關(guān)于膠原蛋白海綿促進(jìn)牙槽窩愈合的實(shí)驗(yàn)研究相繼被報(bào)道，但缺乏基因水平研究[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究膠原蛋白海綿植入對(duì)牙槽窩組織成骨相關(guān)基因ALP的早期表達(dá)水平變化的影響，進(jìn)一步從分子水平為膠原蛋白海綿的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

健康雌性SD大鼠16只，4周齡，體重約(250±12.5)g左右，飼養(yǎng)于泰山醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，口腔檢查無(wú)疾患，飲食活動(dòng)正常。膠原蛋白海綿采用倍菱牌，購(gòu)自北京益而康生物開(kāi)發(fā)中心。

1.1.2主要試劑及設(shè)備

實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒qPCR Mix (Bio-Rad公司)，反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒 Goscript (購(gòu)自 Promega 公司)，RNA提取應(yīng)用Trizol試劑盒(購(gòu)自Generay生物公司)。武漢塞維爾科技有限公司合成ALP基因，上游引物：5'-GGATCAAAGCAGCATCTTACCAG-3'，下游引物：5'-GCTTTCCCATCTTCCGACACT -3'；GADPH基因上游引物：5'-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3'，下游引物：5'-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3'。主要設(shè)備定量PCR儀為Stepone plus (ABI,美國(guó))，臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)D3024R (DragonLab,中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物模型建立

用10%水合氯醛將SD大鼠麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，術(shù)區(qū)采用碘伏消毒，分離右側(cè)上頜第一磨牙牙齦，用口腔探針的三彎端從上頜第一磨牙腭側(cè)插入根分叉，輕輕撬動(dòng)，直至牙齒松動(dòng)脫位，將膠原蛋白海綿放入牙槽窩，至骨水平，縫合固定。左側(cè)為對(duì)照側(cè)，同法拔除上頜第一磨牙，復(fù)位縫合，縫線均采用5-0可吸收縫線，均縫合一針。注意觀察大鼠呼吸，避免窒息。老鼠術(shù)后復(fù)蘇良好，飲食活動(dòng)正常。分別在術(shù)后1周、2周、4周、8周各處死老鼠4 只，取老鼠拔牙窩的牙槽骨及肉芽組織，進(jìn)行基因檢測(cè)。

1.2.2實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因ALP表達(dá)

按照試劑盒操作步驟，對(duì)樣本進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，置于冰箱，-20 ℃保存。之后運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定ALP基因表達(dá)情況。采用2-△△CT法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組ALP基因的表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

ALP基因在實(shí)驗(yàn)側(cè)組織及對(duì)照側(cè)組織中均有表達(dá)，術(shù)后1周、2周、4周、8周，實(shí)驗(yàn)側(cè)組織中ALP基因表達(dá)相對(duì)定量分別為(6.41±0.63)，(10.76±0.46)，(4.46±0.65)，(1.75±0.45)，均顯著高于對(duì)照側(cè)組織(P<0.05)，術(shù)后ALP基因相對(duì)定量分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 術(shù)后基因ALP表達(dá)的定量PCR分析結(jié)果

3 討 論

拔牙創(chuàng)的愈合實(shí)際上是一個(gè)骨組織的修復(fù)再生的動(dòng)態(tài)過(guò)程，該過(guò)程較慢，通常拔牙術(shù)后需要3個(gè)月之久新生骨才能達(dá)到吸收的牙槽嵴頂水平[1]，因此預(yù)防拔牙后牙槽嵴吸收，加速骨組織的修復(fù)再生過(guò)程，對(duì)于各種后續(xù)牙科操作具有重要的臨床意義。 目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于如何避免拔牙后牙槽骨吸收的研究越來(lái)越受到關(guān)注。Wang等[4]主要從微創(chuàng)拔牙、處理牙槽窩骨壁獲得充足血液、骨移植材料填入牙槽窩內(nèi)2/3深度、創(chuàng)傷敷料填充剩1/3深度、8字縫合牙槽窩、應(yīng)用卵圓形義齒幫助牙齦成形。Fowler等[5]推崇“Bio-Col technique”技術(shù)，也是在微創(chuàng)拔牙的基礎(chǔ)上，固有牙槽骨壁鑿孔出血，Bio-oss充填，放置 Collaplug縫合等。而Landsberg[6]通過(guò)采用拔牙窩內(nèi)骨移植及拔牙窩頂軟組織移植的牙槽窩封閉術(shù)進(jìn)行臨床試驗(yàn)，取得了良好效果。2009年Simon等[7]對(duì)自體富血小板纖維蛋白基質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)植入自體富血小板纖維蛋白基質(zhì)的牙槽窩愈合速度更快，即使不用生物膜也能取得較好的效果。生物膜的應(yīng)用對(duì)拔牙后骨缺損病例進(jìn)行植骨蓋膜，可有效促進(jìn)缺損骨修復(fù)。Lasella等[8]對(duì)異種骨加膠原膜進(jìn)行牙槽骨保存的實(shí)驗(yàn)，術(shù)后7個(gè)月，實(shí)驗(yàn)組成骨比例明顯高于對(duì)照組。盡管這些研究取得了明顯效果，可是因手術(shù)的復(fù)雜性、植入材料及生物膜的高昂價(jià)格等諸多因素限制，難以在臨床廣泛應(yīng)用。

膠原是動(dòng)物體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì)，也是器官中結(jié)締組織的主要成分。研究表明，膠原和其他蛋白質(zhì)相比不易引起抗體產(chǎn)生，所有從哺乳動(dòng)物分離提取的Ⅰ型膠原非常相似，因而不易被人體免疫系統(tǒng)作為外體識(shí)別。膠原蛋白海綿在體內(nèi)可以降解成無(wú)毒天然產(chǎn)物。再者，膠原蛋白海綿具有易于加工、滅菌和保存等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，被視為最有用途的生物材料，早已廣泛應(yīng)用于止血、組織缺損充填修復(fù)以及組織工程支架等領(lǐng)域[9-11]。膠原蛋白是骨組織主要成分之一，可加速骨修復(fù)，它能夠?yàn)榻M織鈣化提供必需的的三維結(jié)構(gòu)，而且位于其表面的骨鈣素結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)礦物沉積有一定誘導(dǎo)作用，可促進(jìn)新骨的形成[8]。朱曉琴等[3]通過(guò)建立兔拔牙模型，通過(guò)骨密度檢測(cè)和組織學(xué)檢查初步證實(shí)膠原蛋白海綿填入拔牙創(chuàng)能促進(jìn)牙槽窩的早期骨愈合。本實(shí)驗(yàn)在其研究基礎(chǔ)之上，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)進(jìn)一步探討膠原蛋白海綿填入拔牙創(chuàng)后促進(jìn)牙槽窩早期骨愈合的分子機(jī)制。通過(guò)建立大鼠拔牙模型，選取拔牙術(shù)后 1、2、4、8周作為研究時(shí)間點(diǎn)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因 ALP的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)拔牙后填充膠原蛋白海綿的實(shí)驗(yàn)側(cè)組織ALP表達(dá)上調(diào)，該結(jié)果與目前文獻(xiàn)中報(bào)道的成骨誘導(dǎo)劑處理拔牙創(chuàng)組織相關(guān)成骨基因表達(dá)水平變化較為一致。

綜上，本研究從分子水平證實(shí)膠原蛋白海綿填塞拔牙創(chuàng)后ALP基因顯著上調(diào)，促進(jìn)成骨效果明顯，為探索膠原蛋白海綿促進(jìn)成骨的機(jī)制研究提供了初步的參考資料，本課題計(jì)劃未來(lái)采用基因芯片技術(shù)進(jìn)一步探索膠原蛋白海綿填充對(duì)于拔牙創(chuàng)愈合過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)變化情況，深入探索膠原蛋白海綿促進(jìn)成骨的分子機(jī)制。