尹祥佳 焦珍珍 趙慧軍 李艷玫 賈國(guó)軍 郝 楠 南 銘 李世風(fēng) 張東峰

（1蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070；2北京通州國(guó)際種業(yè)科技有限公司，北京101100；3定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，甘肅定西743000；4甘肅省敦煌種業(yè)股份有限公司，酒泉735000）

玉米是第一個(gè)成功利用雜種優(yōu)勢(shì)的作物，也是利用雜種優(yōu)勢(shì)面積最大的作物[1]。2017年我國(guó)玉米播種面積3544.5萬(wàn) hm2，總產(chǎn)量2158.9億kg[2]，成為近10年來(lái)種植面積和產(chǎn)量增加最多、最快的農(nóng)作物[3]，播種面積和產(chǎn)量均居我國(guó)四大作物之首。國(guó)內(nèi)90%以上的玉米生產(chǎn)用種是單交種[4]，近年來(lái)國(guó)內(nèi)玉米新品種種類較多，2017年就有國(guó)審玉米品種171個(gè)，國(guó)家完成統(tǒng)一試驗(yàn)程序的品種302個(gè)，聯(lián)合體292個(gè)、綠色通道278個(gè)、引種備案玉米品種861個(gè)。因此，玉米種子作為我國(guó)種業(yè)的主導(dǎo)產(chǎn)品，雜交種質(zhì)量好壞直接影響玉米大田生產(chǎn)、新品種市場(chǎng)規(guī)模及種子企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[5]。

玉米種子的純度是質(zhì)量監(jiān)管的重要指標(biāo)之一。快速、標(biāo)準(zhǔn)的玉米種子質(zhì)量檢測(cè)方法是保護(hù)農(nóng)民利益、維護(hù)育種家權(quán)益的重要措施[6]。傳統(tǒng)的玉米種子純度鑒定主要有形態(tài)鑒定、同工酶和貯藏蛋白質(zhì)電泳技術(shù)，但由于多態(tài)性有限，隨著玉米品種數(shù)量逐年增多，特別是大量近似品種的存在，難以做出有效鑒定[7]。DNA是生物遺傳信息的直接載體，分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映[8]。分子標(biāo)記主要有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLPs）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPDs）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLPs）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）和簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSRs）。簡(jiǎn)單序列重復(fù)具有技術(shù)簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠、重復(fù)性好、共顯性遺傳、可區(qū)分雜合子和純合子等眾多優(yōu)點(diǎn)在玉米種子純度鑒定中有著廣泛的應(yīng)用[9]。目前，SSRs分析大多用PAGE膠分離銀染檢測(cè)，試驗(yàn)存在耗時(shí)、耗力、非自動(dòng)化，不適用大規(guī)模、多批次的數(shù)據(jù)收集和分析等問(wèn)題。SSR熒光標(biāo)記技術(shù)因具有高效、精確、靈敏、自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，主要應(yīng)用于玉米品種的遺傳分析，但用于鑒定玉米雜交種純度的文獻(xiàn)報(bào)道很少[10-11]，因此，本研究利用SSR熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)5個(gè)推廣的玉米雜交種進(jìn)行了純度鑒定研究，研究結(jié)果可為SSR熒光標(biāo)記快速鑒定玉米雜交種純度提供參考依據(jù)，為逐步完善玉米純度鑒定方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料金穗1203、金艾130、武科8號(hào)、方玉36和甘玉801共計(jì)5份玉米雜交種，購(gòu)于甘肅省農(nóng)科院農(nóng)資市場(chǎng)。

1.2 SSR標(biāo)記引物SSR標(biāo)記引物參考《玉米品種鑒定DNA指紋方法》（NY/T 1432-2014），以及George 等[12]、Kahler等[13]、王鳳格等[14]、吳金鳳[15]和蘭琴英等[16]報(bào)道的文獻(xiàn)，SSR引物的5′端分別用NED、PET、FAM、VIC等進(jìn)行熒光標(biāo)記（Applied Biosystems，USA公司合成），20對(duì)核心引物信息見(jiàn)表1。

表1 20對(duì)引物信息

1.3 試驗(yàn)方法基因組DNA提取。采取改良的CTAB法提取基因組DNA：取種子發(fā)芽長(zhǎng)出的新葉按順序放到2mL 96深孔板中，加2顆3mm鋼珠，將采集好的樣品放到凍干機(jī)里進(jìn)行凍干干燥20～24h后加 600μL CTAB，蓋上硅膠蓋，研磨 3min，取出看是否磨碎，根據(jù)情況可再研磨2～5min；將研磨好的深孔板放到離心機(jī)中，4000r/min離心2min；75℃烘箱放置30min，每10min輕輕搖動(dòng)1次；冷卻后，加600μL氯仿抽提，恒溫振蕩培養(yǎng)箱25℃，搖勻5min；4000r/min離心10min，取300μL上清液移至新的1.2mL 96深孔板；向上清液中加入0.7倍體積的冰異丙醇沉降DNA，加蓋硅膠蓋后放置-20℃條件下 15～30min；4000r/min離心10min，去上清，然后加入200μL 75%的乙醇，4000r/min離心10min，去上清后晾干；加入50μL ddH2O溶解。DNA質(zhì)量和濃度用NanoDrop2000（Thermo Scientific）紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，調(diào)節(jié)工作液濃度。

SSR熒光標(biāo)記引物篩選。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[17-18]報(bào)道的玉米群體遺傳多樣性研究的取樣技術(shù)，采用每份樣品隨機(jī)選取15粒種子培養(yǎng)成單株取樣組成一個(gè)混合樣本的方法提取DNA作為引物篩選PCR擴(kuò)增模板。從20對(duì)引物中隨機(jī)選取10對(duì)核心引物。PCR 反應(yīng)在 Veriti 96 well Thermalcycler（eppendorf）上進(jìn)行。PCR 反應(yīng)體系為 10μL，其中，DNA（50ng/μL）2μL，2xMix5.0 μL，Left primer（10μmol/L）0.1μL，Right primer（10μmol/L）0.1μL，ddH2O 2.8μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性10min，95℃變性20s，60℃復(fù)性30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)后72℃終延伸10min，4℃循環(huán)，復(fù)性溫度根據(jù)不同引物進(jìn)行調(diào)整。反應(yīng)完后取PCR產(chǎn)物1μL，加入甲酰胺（HIDI）8.9μL，分子量?jī)?nèi)標(biāo) LIZ0.1μL混勻后在 PCR 儀上95℃變性 5min，于 4℃保存 10min，2000r/min 離心1min，用 ABI3730XL（Applied Biosystems）DNA 分析儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行自動(dòng)熒光檢測(cè)。

SSR熒光標(biāo)記純度鑒定。每份雜交玉米種隨機(jī)取96粒種子作為純度鑒定樣品，單獨(dú)提取DNA，用篩選的具有多態(tài)性的2對(duì)熒光標(biāo)記核心引物分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，用ABI3730XL（Applied Biosystems）DNA 分析儀對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行自動(dòng)熒光檢測(cè)。

數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)。采用Data Collection v3.0軟件整理數(shù)據(jù)，用Gene Marker 2.2.0軟件確定分子量。將毛細(xì)管電泳檢測(cè)所得的SSR擴(kuò)增片段信息輸入Microsoft Excel，計(jì)算玉米雜交種的純度，公式為P（%）=（NT-ND）/NT×100，其中，P為種子純度，NT為供檢種子數(shù)，ND為雜交種子數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取質(zhì)量分析用NanoDrop2000（Thermo Scientific）紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的玉米雜交種基因組DNA濃度，并調(diào)節(jié)濃度為50ng/μL，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，結(jié)果表明，提取的玉米基因組DNA主帶清晰一致，適合進(jìn)一步的SSR-PCR分析。

圖1 玉米基因組DNA檢測(cè)結(jié)果

2.2 SSR熒光標(biāo)記引物篩選結(jié)果采用了15個(gè)單株混合取樣的方法，隨機(jī)選取引物P01、P03、P05、P08、P09、P11、P13、P16、P17、P20 等 10 對(duì) SSR熒光標(biāo)記引物分別對(duì)金穗1203、金艾130、武科8號(hào)、方玉36和甘玉801等5份玉米品種進(jìn)行多態(tài)性引物篩選，篩選結(jié)果見(jiàn)圖2～6。SSR熒光標(biāo)記引物篩選的3個(gè)原則：一是具有雙峰；二是峰值盡量單一、清晰；三是雙峰的峰值差異不大。根據(jù)引物篩選原則，各篩選出了鑒定5份玉米品種純度的2對(duì)SSR熒光標(biāo)記引物，共篩選出了7對(duì)引物，分別為bnlg439w1、umc1705w1、umc2007y4、umc1506k12、bnlg2291k4、phi080k15、umc2015k3（表 2）。

圖2 金穗1203玉米品種SSR引物篩選結(jié)果

圖3 金艾130玉米品種SSR引物篩選結(jié)果

圖4 武科8號(hào)玉米品種SSR引物篩選結(jié)果

圖5 方玉36玉米品種SSR引物篩選結(jié)果

圖6 甘玉801玉米品種SSR引物篩選結(jié)果

表2 鑒定5份玉米品種純度的引物

2.3 SSR熒光標(biāo)記純度鑒定結(jié)果每份玉米品種隨機(jī)選取96粒種子樣品單獨(dú)提取基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板，根據(jù)篩選出的2對(duì)熒光標(biāo)記引物進(jìn)行了純度鑒定，若鑒定結(jié)果峰圖是雙峰，且是引物篩選的峰值，則判斷為是雜交種；若結(jié)果是雙峰，但有一個(gè)位點(diǎn)是篩選的峰值，另一個(gè)位點(diǎn)是其他峰值，則判斷為是異交種；若結(jié)果是雙峰，但2個(gè)位點(diǎn)都不是引物篩選時(shí)的峰值，則判斷為是雜株；若2個(gè)引物在該位點(diǎn)都是單峰，且峰值是引物篩選中的一個(gè)峰值，則判斷為是自交種。鑒定部分結(jié)果見(jiàn)圖7，純度值在96.88%～98.44%之間（表3），達(dá)到了96%的玉米雜交種純度國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論與討論

玉米中SSR多態(tài)性標(biāo)記極為豐富，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)可檢測(cè)玉米染色體上不同位點(diǎn)的簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性，能夠有效鑒定雜交種的純度。玉米雜交種純度鑒定需要用特異引物或引物組合來(lái)完成自交苗和異型株檢測(cè)區(qū)分，因此，引物的篩選就顯得尤為重要。朱盛安等[19]利用50對(duì)SSR引物對(duì)收集到的18個(gè)玉米雜交種及其親本進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，篩選了一套玉米雜交種純度鑒定的核心SSR引物。劉文彬等[20]分別用 Qiagen和ABI3730兩種DNA分析儀，從111對(duì)新型玉米 SSR引物中篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、適于自動(dòng)化分型的9對(duì)引物。馮博等[21]確定京科968玉米品種純度鑒定的SSR熒光標(biāo)記引物組合。本試驗(yàn)在20對(duì)SSR核心引物中分別篩選到了鑒定5個(gè)推廣玉米品種的7對(duì)純度鑒定引物，使用高分辨率的ABI3730xI DNA分析儀進(jìn)行了純度鑒定。選用4種熒光標(biāo)記，根據(jù)峰值來(lái)判斷引物相對(duì)擴(kuò)增效率，且通量較高，數(shù)據(jù)分析簡(jiǎn)便。能夠有效克服聚丙烯酰胺凝膠電泳帶來(lái)的操作較為繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、通量低、不適于大量引物的篩選鑒定問(wèn)題。

圖7 SSR熒光標(biāo)記鑒定玉米品種純度的部分結(jié)果

表3 玉米品種純度鑒定結(jié)果

SSR熒光標(biāo)記應(yīng)用于鑒定玉米品種純度，可以大大縮短種子純度的檢測(cè)時(shí)間，及時(shí)確定不同玉米品種種子質(zhì)量，主要表現(xiàn)在3個(gè)方面：一是玉米種業(yè)企業(yè)可以準(zhǔn)確快速檢測(cè)玉米種子的純度，保證種子的真實(shí)性，可以建立起玉米種業(yè)企業(yè)的制種質(zhì)量監(jiān)控體系，有效促進(jìn)玉米田間制種技術(shù)規(guī)程的使用效果，嚴(yán)格做好去雜和去雄的工作；二是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種保護(hù)辦公室在受理玉米新品種保護(hù)時(shí)，利用SSR熒光標(biāo)記幫助做好DUS測(cè)試，給申請(qǐng)品種一個(gè)身份權(quán)利保護(hù)標(biāo)識(shí)，加強(qiáng)玉米新品種保護(hù)的效力；三是在每年各級(jí)種子管理部門的種子市場(chǎng)執(zhí)法檢查時(shí)可以快速對(duì)種子純度進(jìn)行檢測(cè)，以此來(lái)保護(hù)農(nóng)戶的權(quán)益，保障玉米生產(chǎn)安全。

本研究選用甘肅推廣的金穗1203、金艾130、武科8號(hào)、方玉36和甘玉801等5個(gè)玉米雜交種，采用15個(gè)單株混合取樣法提取DNA作為熒光標(biāo)記引物篩選PCR擴(kuò)增模板，篩選了7對(duì)SSR熒光標(biāo)記引物并進(jìn)行了純度鑒定研究，結(jié)果表明，純度值在96.88%～98.44%之間，達(dá)到了96%的玉米雜交種純度國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。研究結(jié)果為應(yīng)用ABI3730XL DNA分析儀快速鑒定玉米雜交種純度提供了參考，同時(shí)為逐步完善玉米純度鑒定方法奠定了基礎(chǔ)。