郭清艷，鈕冰，楊捷琳

（1.上海大學生命科學學院，上海 200444；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135）

0 引 言

克羅諾桿菌屬Cronobacterspp.(2008年之前被稱為阪崎腸桿菌E.sakazakii)，在自然界中分布廣泛，可在嬰幼兒配方奶粉，沖調(diào)器具，奶粉加工場地及設(shè)備中分離到該菌[1-4]。阪崎克羅諾桿菌C.sakazakii作為Cronobacterspp.的代表菌種，易使免疫力低下的各階段人群感染患病，如腦膜炎，敗血癥和壞死性結(jié)腸炎[5]。早產(chǎn)兒，體重不足的新生兒以及嬰幼兒易感染C.

sakazakii，并造成40%～80%的致死率[6-9]。2002年，國際微生物食品標準委員會將E.sakazakii劃分為對部分人群存在嚴重危害的致病菌[10]。我國食藥監(jiān)局在2006版的《嬰幼兒配方奶粉生產(chǎn)許可證審查細則》中明確指出不得檢出E.sakazakii[11]。

最早E.sakazakii被認為是腸桿菌科、腸桿菌屬(Enterobacterspp.)中陰溝腸桿菌的生物變型菌，并被命名為“黃色陰溝腸桿菌(yellow-pigmentedEnterobacter cloacae)”。直到1980年，F(xiàn)armer等做了一系列實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“黃色陰溝腸桿菌”與檸檬酸桿菌屬和腸桿菌屬中的細菌有41%～50%的關(guān)聯(lián)，其表型和DNA與腸桿菌屬中的陰溝腸桿菌相似性更接近(50%)，由此將其歸于腸桿菌屬。但“黃色陰溝腸桿菌”與陰溝腸桿菌在個別生化反應上不同，為此Farmer等建議將“yellow-pigmentedEnterobactercloacae”更名為“Enterobactersakazakii”[12]。此名稱被廣泛地采納，并沿用至今。2007年Iversen等通過對210株阪崎腸桿菌的多相分析方法測定，建立一個囊括了原來所有阪崎腸桿菌的新屬Cronobactergen.nov。這個新屬包括5個種分別是：Cronobactersakazakii、C.turicensis、C.malonaticus、C.muytjensii和C.dublinensis[13]。2012年對該屬的再次修訂，確定由7種菌種組成，添加C.universalis和C.condimenti。該分類是由全基因組分析支持，奠定7個菌種的分類地位[14-16]。

隨著Cronobacterspp.分類的不斷完整和細化，相應的鑒定分型技術(shù)也在不斷發(fā)展。2002美國食品藥品管理局(U.S.Food and Drug Administration,FDA)推薦的嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的分析與計數(shù)檢測程序，MPN(Most Probable Number)法是阪崎腸桿菌早期的檢測方法。該方法一直被認為是阪崎桿菌檢測的經(jīng)典方法，但耗時7 d左右，靈敏度不高且操作繁瑣[17]。API 20E(bioMe’rieux,法國)是革蘭氏陰性腸道菌鑒定的常用的商品化試劑條[18]。Centinkaya[19]，Turcovsky[20]和Pan[21]都曾利用此方法對E.sakazakii進行生化鑒定。該方法成本低，反應快，但只可鑒定到屬的水平，且結(jié)果判定會因人而異，易產(chǎn)生誤差。脈沖場凝膠電泳(PFGE)是針對致病菌爆發(fā)分子流行病學調(diào)查的黃金標準方法[22]。但PFGE存在一定限制,即使通過軟件分析PFGE凝膠的圖像，也需要對凝膠中位移或弱條帶進行主觀的視覺判定，這樣就會引入人為誤差[23]。

相比之下，全基因組比較分析揭示了大量的遺傳多樣性，可用于將病原菌進行快速準確地分類，甚至到單一菌株水平。針對遺傳相關(guān)性十分接近的致病菌全基因組測序比PFGE更加準確且分辨率更高，并提供許多額外的信息，包括MLST、單核苷酸多態(tài)性、功能基因分析等[24]。Antwerpen對15株土拉弗朗西斯菌(T.tularensis)的進行全基因組測序，推出了一種新的基因研究方法MLST+[25]。McRobb結(jié)合了全基因組缺失基因分析和SNP系統(tǒng)進化樹，對于研究流行病學致病菌提供了更高的分辨率[26]。目前對大腸桿菌已有較為深入的研究，其被分為許多亞型，每種亞型都具有不同的毒性和抗性。Ferdou發(fā)現(xiàn)對132株產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌分離株進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)屬于44種不同的序列類型(ST)，42種血清型和14種STX亞型組合[27]。

由于Cronobacterspp.分類地位的變化，導致目前對于Cronobacterspp.的溯源體系更為復雜多樣，采用何種更加有效的溯源分析方法，有效識別污染來源，對乳制品生產(chǎn)中Cronobacterspp.的防控更為重要。我們期待通過比較兩種分子分型方法，證實全基因組測序方法是對Cronobacterspp.進行溯源分析或功能分析的重要研究手段。

1 材料與方法

1.1 材料

2005-2006年，在上?？诎秾M口乳品進行阪崎腸桿菌檢測，共分離獲49株阪崎腸桿菌，乳制品包括嬰幼兒奶粉，食品配料包括乳清粉和乳清蛋白粉，奶酪，奶粉以及其他類型的進口乳制品，其中29%是乳清粉和乳清蛋白粉。乳制品來自9個不同的國家，其中新西蘭占最大比49%。樣品信息詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離、復蘇與DNA的提取

參照美國FDA和加拿大衛(wèi)生部健康產(chǎn)品和食品部的推薦方法[28-29]，進行樣品處理和E.sakazakii的分離。生化鑒定按API 20E試劑條產(chǎn)品說明書進行。按無菌操作程序進行取樣前的樣品袋表面處理。每份樣品取約40 g，放入已預熱到45℃裝有360 mL無菌水的三角燒瓶中，輕輕搖動使其充分溶解，36℃孵育過夜。移取上述混合液10 mL轉(zhuǎn)種到90 mL無菌腸道桿菌增菌肉湯中，36℃孵育過夜。充分混合增菌培養(yǎng)液，分別在結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上進行直接涂布或劃線分離，36℃培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)后，觀察平板上的菌落特征，挑取紫色及粉色疑似菌落分別劃線接種到胰蛋白酶大豆瓊脂平板，25℃培養(yǎng)48～72 h。挑取TSA瓊脂平板上所有菌落，根據(jù)API 20E試驗指南進行生化鑒定，同時做氧化酶試驗。

分離獲得的所有菌株在-80℃下使用磁珠保存法儲存至今。49個菌株被成功復蘇，制成菌懸液。采用CTAB法提取細菌基因組DNA。

1.2.2 基因組測序組裝

采用Illumina HiSeq 2500平臺完成全基因組測序。對DNA碎片進行環(huán)化擴增，文庫構(gòu)建。經(jīng)末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟完成整個文庫制備。文庫構(gòu)建完成后，進行初步定量稀釋、檢測，插入片段大小再次準確定量確保文庫質(zhì)量。最后進行測序。原始數(shù)據(jù)進行過濾處理后，將有效數(shù)據(jù)(Clean Data)。使用 SOAPdenovo（version 2.04）軟件進行組裝[30-31]。

1.2.3 多位點序列分型

目前數(shù)據(jù)中現(xiàn)有的Cronobacterspp.記錄有2000多株，分別來自23個以上的國家，源自中國的菌株占33.26%。管家基因為基因組內(nèi)400-600bp的核苷酸序列，每個位點根據(jù)其發(fā)現(xiàn)的時間順序賦予一個等位基因編號，每一株菌的等位基因編號按照指定的順序排列就是它的等位基因譜，也就是這株菌的序列型[32]。

Cronobacterspp.的7個管家基因分別是atpD,fusA,glnS,gltB,gyrB,infB,pps。菌株的序列型通過CronobacterMLST公共數(shù)據(jù)庫上(https：//pubmlst.org/cronobacter/)的在線工具確定，選擇Sequence query下的MLST，再將49個菌株的全基因組數(shù)據(jù)粘貼到數(shù)據(jù)庫，得到菌株的ST[33]。并在線使用geoBRUST軟件，依據(jù)7管家基因位點和國家生成分布圖(圖1)。

表1 49株菌株的基本信息和序列型

1.2.4 單核苷酸多態(tài)性位點分析

對32株ST13的阪崎克羅諾桿菌進行SNP分析，使用軟件SMALT和SAMtools[29-30]。選取最早分離得到的菌株CS-1作為參考序列。使用VCFTools軟件對VCF文件過濾，參數(shù)設(shè)定為得分最低30，深度最小8.0以及等位基因頻率最小0.90[34-36]。SNP分析結(jié)果包括同義突變和反義突變。每個突變位點被串聯(lián)一起，依據(jù)最大似然法構(gòu)建進化樹，最后使用Figtree v 1.3軟件進行可視化和注釋。

2 結(jié)果

2.1 MLST分型

49個C.sakazaii菌株通過MLST分型，分為8個不同的序列型，包括 ST1，ST4，ST 13，ST375，ST12，ST21，ST233和ST42。各序列型占比極不平衡。圖1中ST13的Csakazakii(n=32，65.3%)占絕對優(yōu)勢，其次是 ST 4(n=6，12.2%)，ST 375占 比 8%(n=4)。 ST12，ST 233，ST42，ST 12均對應單個菌株。ST13菌株中來源組成多樣且不平均，共6個國家，其中新西蘭來源占50%（16/32）。ST4由三個國家組成，美國占比50%。ST 375由新西蘭和波蘭占一半比例。圖2是產(chǎn)品種類與序列型之間的關(guān)系。同樣ST 13菌株的產(chǎn)品類型組成最為復雜，其中嬰幼兒奶粉占比最大，其次是ST 4菌株來自4種產(chǎn)品組成，食品配料占比最大。

圖1 菌株的序列型與國家之間的關(guān)系

圖2 菌株的序列型與產(chǎn)品類別之間的關(guān)系

2.2 CC13菌株的SNP分析

為了對ST13的C.sakazakii的深入分析，采用SNP方法進行分型，結(jié)果分為4個Group和5個單獨的菌株。表2統(tǒng)計了各ST13菌株詳細的SNP數(shù)量，由圖3可知，Group 1包括12個菌株，CS-6和CS-37單核苷酸多態(tài)性位點最多11。Group2形成兩個明顯的分支，每個分子由4個菌株組成。Group3僅由兩個菌株組成，來自新西蘭的CS-19和CS-36。Group4由5個菌株組成，最大的SNP數(shù)仍是11。此外獨立的5個菌株分別是CS-72，CS-18，CS-71，CS-56和CS-48,其中CS-71含有5378個SNP,遠高于其他菌株的SNP數(shù)。

表2 ST13 C.sakazakii菌株的SNP分析結(jié)果

圖3 ST13株阪崎克羅諾桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

一直以來，MLST多位點序列分型方法被認為是區(qū)分Cronobacterspp.菌株穩(wěn)定且可靠的方法。圖1顯示8種已知不同的序列型之間的關(guān)系，并可見菌株序列型和地理位置上存在的不平衡分布，有一定相關(guān)性，相同序列型的菌株聚簇明顯跟菌株的分離國家相關(guān)[37-38]，比如說CC13有超過一半的菌株源自新西蘭。MLST分型共得到8個不同的ST序列型，其中4個ST(ST 1，ST4，ST12，ST13)都與C.sakazakii感染臨床案例有關(guān)[39-41]。值得注意的是，ST13菌株在本研究占有絕對優(yōu)勢比例（65%）。1994年法國的新生兒重癥監(jiān)護室因C.sakazakii感染引發(fā)疾病爆發(fā)，調(diào)查分離得到5株ST 13的C.sakazakii菌株[40]。分離自嬰幼兒乳制品的10株C.sakazakii，全部屬于ST13。當時未見國內(nèi)因感染阪崎腸桿菌的臨床案例報道，可能與當時對該菌的認識不夠透徹相關(guān)。ST4菌株的來源多樣，包括美國，意大利，和新西蘭。相隔甚遠的三個國家，位于三個不同的大洲，證明在ST4C.sakazakii的分布廣泛以及較強的適應性。

針對食源性致病菌流行病事件的溯源分析，多位點序列分析是進行初步分型的有力工具。但對于對序列相似較高的菌株的分型，存在一定限制。單核苷酸多態(tài)性位點分析（SNP分析）被證明在DNA水平上擁有最全面最準確的的分辨能力。故我們選擇SNP分析對32株ST13C.sakazakii進一步分型分析。圖3可見由32個ST13菌株組成的最復雜的系,通過SNP分型，被分成4個Group和5個獨立的菌株。5個獨立的菌株中，源自法國的CS71含最多的SNP數(shù)，距離參考序列CS1最遠。而其余4個獨立的菌株均源自新西蘭，SNP數(shù)在8～15之間。在圖3中Group1是相對最復雜的組分，其中CS61和CS32，CS14和CS66在Group1中分別擁有共同的祖先，且也源自相同國家新西蘭和美國，證明來自同一國家的菌株傾向于聚簇在一起。Group2由8個菌株組成，形成兩個明顯分支，兩個分支的傳播路徑均是從大洋洲的新西蘭，澳大利亞到歐洲的法國。Group3是源自新西蘭的兩株阪崎克羅諾桿菌，再次證明序列型與國家之間的相關(guān)性。由5個菌株組成的Group4，傳播路徑是從美國到澳大利亞，再至新西蘭。明顯Group2和Group4的傳播方向在地理上剛好構(gòu)成一個三角循環(huán)，不難想象在2005-2006年間，在歐洲，大洋洲，北美洲的乳制品之間的頻繁貿(mào)易，的確對ST13C.sakazakii的傳播有促進作用。

通過全基因組測序，我們不僅可以獲得其MLST分型結(jié)果，還可以對相同ST的菌株做進一步的個性化分析，如文中采用了單核苷酸多態(tài)性位點分型方法，成功對32株ST13菌株進一步分型，為類似致病菌的溯源分析提供思路。隨著下一代測序技術(shù)的不斷發(fā)展和普及，如今二代測序的成本已大大降低，測序時間也大為縮短，其價格基本等同于單做多位點序列分析的費用，因此通過本次研究，我們提倡在對致病菌進行溯源分析時采用全基因組分析，同時還可以深入進行基因組的功能分析。

4 結(jié) 論

本研究為乳制品攜帶C.sakazakii致病菌污染事件的分子溯源提供了技術(shù)儲備,豐富了C.sakazakii的MLST數(shù)據(jù)庫，為應用全基因組測序進行MLST和SNP方法研究分析不同來源Cronobacterspp.的分子流行病學提供依據(jù),有助于該菌的主動監(jiān)測和溯源,為預防和控制與該菌有關(guān)的食源性疾病發(fā)揮重要的作用。