謝 晶，尹義捐，楊欲成，金晨鐘,*，王雙輝，盧 超

（1.湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000；2. 湖南人文科技學(xué)院，湖南省農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 婁底 417000）

我國(guó)的畜骨和禽骨資源極為豐富，但是由于技術(shù)水平的限制，對(duì)這一優(yōu)質(zhì)營(yíng)養(yǎng)資源的利用卻很落后。我國(guó)對(duì)畜禽骨的深加工利用率不足1%，造成許多畜禽骨的極度浪費(fèi)，一般只能將其丟棄或是加工成商品附加值不高的產(chǎn)品，如簡(jiǎn)單的骨粉、骨泥、飼料和食品調(diào)味料等[1-2]。鵝骨是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高的畜禽屠宰加工副產(chǎn)品，在動(dòng)物體中約占25%，骨骼中90%的蛋白為膠原、骨膠原及軟骨素等。但鵝骨在我國(guó)畜禽骨開(kāi)發(fā)利用中所占比例較小，隨著我國(guó)對(duì)硫酸軟骨素的需求不斷增大，從鵝骨中提取硫酸軟骨素的研究有著重要意義[3-4]。

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是具有硫酸基、羧基和乙酰基的一類(lèi)糖胺聚糖[5-6]，廣泛存在于動(dòng)物軟骨、骨、肌腱、肌膜和血管壁中[7]，具有增加骨密度[8]、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分裂與發(fā)育[9]、消炎[10]等功能。CS具有降血脂、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、提高免疫力等多種藥理活性，能夠防止動(dòng)物和人體的動(dòng)脈硬化，且能防治冠狀動(dòng)脈心臟病的發(fā)作[11-12]。在國(guó)外，用鯊魚(yú)硫酸軟骨素來(lái)治療和預(yù)防癌癥及疑難癥，效果明顯。隨著對(duì)CS生理功能及其生化性質(zhì)的深入研究，在國(guó)外CS已成為流行的保健品添加劑，也常作為膳食補(bǔ)充劑用于保護(hù)關(guān)節(jié)[13-15]。目前有不少工廠生產(chǎn)CS，但大多采用濃堿法、稀堿法、中性鹽法等傳統(tǒng)工藝，精制工藝往往要經(jīng)過(guò)除雜、脫色等過(guò)程，工藝控制繁瑣，因而質(zhì)量不穩(wěn)定、收率降低，而且堿、鹽易對(duì)環(huán)境造成污染[16-19]。

本研究以麻陽(yáng)鵝鵝全骨為原料，采取堿提-酶解-醇沉的方法制備CS，重點(diǎn)對(duì)酶解這一直接影響CS提取率的關(guān)鍵步驟進(jìn)行優(yōu)化研究，以提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上優(yōu)化工藝，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化分析法最終確定最佳工藝參數(shù)。本研究擬通過(guò)對(duì)鵝全骨CS的提取工藝研究，提高其應(yīng)用發(fā)展前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為其進(jìn)一步研究和綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鵝全骨由湖南省懷化市麻陽(yáng)縣懷化苗家王食品有限公司提供。

木瓜蛋白酶（≥800 000 U/g） 上海瑞永生物科技有限公司；胃蛋白酶（≥12 000 U/g）、胰蛋白酶（≥50 000 U/g） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸軟骨素A（chondroitin sulfate A，CSA）標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%）、鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%） 上海源葉生物科技有限公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TG20KR-D高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Waters E2695高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 CS的制備工藝流程

鵝骨高溫蒸煮→清洗→干燥→粉碎→堿提→過(guò)濾→濾液調(diào)pH值→加胰蛋白酶酶解→酶滅活→調(diào)pH值→加蛋白酶→酶滅活→過(guò)濾→濾液加入高嶺土、活性炭脫色→抽濾→調(diào)節(jié)pH值，加入NaCl→醇沉→離心→乙醇洗滌脫水→干燥→粗成品

1.3.2 CS的制備工藝操作要點(diǎn)

1.3.2.1 高溫蒸煮與堿解

將鵝骨投入恒溫蒸煮鍋于90 ℃煮2～4 h，而后放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘烤6～8 h后立即絞碎；稱(chēng)取5 g鵝骨粉，按照原料與質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaOH的比例為1∶6.25（m/V）加入NaOH溶液，室溫浸提12 h；然后用超聲波輔助提取3 h，再用2 mol/L HCl調(diào)pH值至6.0～6.8，雙層紗布過(guò)濾；留下濾液，濾渣再以1∶0.5（m/V）的比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaOH，再用超聲波輔助提取1 h，雙層濾布過(guò)濾；棄濾渣，取濾液，合并2 次濾液，并測(cè)量體積，待用。

1.3.2.2 酶解

濾液用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至8.0～9.0，按照濾液與胰蛋白酶1 000∶1.5（V/m）的比例加入胰蛋白酶，于40～50 ℃水解2 h后，于90 ℃恒溫水浴20 min滅活；調(diào)節(jié)水解液pH值至2.0～4.0，再按1 000∶1.5（V/m）的比例加入胃蛋白酶，40～50 ℃水解4 h；水解完畢后用4 層紗布過(guò)濾，并加入高嶺土和活性炭（使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為0.5%）進(jìn)行吸附，同時(shí)慢速間歇攪拌4 h或快速升溫至90 ℃后間歇攪拌30 min，冷卻后抽濾。

1.3.2.3 沉淀

將1.3.2.2節(jié)所得濾液調(diào)節(jié)pH值至6.8～7.2，加入NaCl使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，再加入2.5 倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇沉淀；待澄清后，棄清液，用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇洗滌沉淀3～4 次，6 000 r/min條件下離心10～15 min，收集沉淀，沉淀物即為CS粗成品。

1.3.2.4 干燥

將上述沉淀物放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，于60～80 ℃直接烘干即得粗成品。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1 蛋白酶種類(lèi)的選擇

全骨原料表面有很多殘存的肌肉和其他結(jié)締組織，還有一層堅(jiān)韌的軟骨膜，它們的存在會(huì)影響CS的提取率和純度。由于全骨中的雜質(zhì)主要成分為蛋白質(zhì)，因此選擇蛋白酶對(duì)全骨進(jìn)行酶解。

在文獻(xiàn)[20-23]的基礎(chǔ)上，以蛋白質(zhì)去除率和CS提取率為指標(biāo)，篩選最佳酶解蛋白酶。為進(jìn)一步了解不同種酶對(duì)鵝全骨中CS提取率的影響，對(duì)木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶在各自的最佳水解條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)比它們對(duì)蛋白質(zhì)的去除效果和CS提取率。

1.3.3.2 胃蛋白酶酶解條件單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以提取率為指標(biāo)，對(duì)胃蛋白酶的酶解條件進(jìn)行優(yōu)

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素編碼及水平Table 1 Codes and levels of independent variables used in response surface methodology

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定

1.3.4.1 蛋白質(zhì)去除率

蛋白質(zhì)去除率按照公式（1）計(jì)算?；?，對(duì)胃蛋白酶加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度和pH值4 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)[24]。

將胰蛋白酶處理后的酶解液用胃蛋白酶處理，酶解時(shí)間為6 h，酶解溫度為45 ℃，pH值為3.0，胃蛋白酶加酶量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L時(shí)，考察胃蛋白酶加酶量對(duì)CS提取率的影響。

將胰蛋白酶處理后的酶解液用胃蛋白酶處理，酶解時(shí)間分別為2、4、6、8、10 h，酶解溫度為45 ℃，pH值為3.0，胃蛋白酶加酶量為1.5 g/L時(shí)，考察酶解時(shí)間對(duì)CS提取率的影響。

將胰蛋白酶處理后的酶解液用胃蛋白酶處理，酶解時(shí)間為6 h，酶解溫度分別為35、40、45、50、55 ℃，pH值為3.0，胃蛋白酶加酶量為1.5 g/L時(shí)，考察酶解溫度對(duì)CS提取率的影響。

將胰蛋白酶處理后的酶解液用胃蛋白酶處理，酶解時(shí)間為6 h，酶解溫度為45 ℃，pH值分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0，胃蛋白酶加酶量為1.5 g/L時(shí)，考察酶解pH值對(duì)CS提取率的影響。

1.3.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用響應(yīng)面法對(duì)酶解過(guò)程中影響CS提取率的因素及因素間的交互影響進(jìn)行優(yōu)化[25-26]，即根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取胃蛋白酶加酶量（A）、酶解時(shí)間（B）、酶解溫度（C）和pH值（D），進(jìn)行4因素3水平試驗(yàn)，利用響應(yīng)面法分析影響胃蛋白酶水解的主次因素，得出該階段的最佳工藝條件。響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素編碼及水平如表1所示。

1.3.4.2 總氮含量

酶解液中總氮含量、酶解前堿提液中總氮含量的測(cè)定：采用凱氏定氮法[27]。

1.3.4.3 CS提取率

CS提取率按照公式（2）計(jì)算。

式中：m為提取所得CS粗品的質(zhì)量/g；m0為鵝骨原料質(zhì)量/g。

1.3.4.4 定性及定量分析

稱(chēng)取25.0 mg經(jīng)105 ℃干燥4 h的CS標(biāo)準(zhǔn)品和25.0 mg鹽酸氨基葡萄糖或樣品于燒杯中，加入5.0 mL乙腈，振蕩使其分散均勻，再加入水，用超聲波使其溶解；轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，CS質(zhì)量濃度約為0.5 mg/mL，鹽酸氨基葡萄糖質(zhì)量濃度約為0.5 mg/mL，樣品溶液濃度未知。用Waters E2695高效液相色譜儀（流動(dòng)相：乙腈-戊烷磺酸鈉溶液（體積比10∶90），C18色譜柱，流速0.8 mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)192 nm）分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，并對(duì)樣品的色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖進(jìn)行對(duì)照[28]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類(lèi)的選擇結(jié)果

表2 不同蛋白酶處理時(shí)的蛋白質(zhì)去除率和CS提取率Table 2 Comparison of protein removal and CS extraction with different proteases

由表2可知，3 種酶的蛋白質(zhì)去除率和CS提取率有明顯不同，其中以胃蛋白酶的應(yīng)用效果最好，從蛋白質(zhì)去除率和CS提取率來(lái)看，胃蛋白酶的綜合效果最佳。

2.2 胃蛋白酶酶解提取CS的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 胃蛋白酶加酶量對(duì)CS提取率的影響

圖1 胃蛋白酶加酶量對(duì)CS提取率的影響Fig. 1 Effect of pepsin dosage on extraction yield of CS

由圖1可知，在胰蛋白酶加酶量為1.5 g/L，胃蛋白酶加酶量為0.5～1.5 g/L時(shí)，CS提取率明顯上升，當(dāng)胃蛋白酶加酶量為1.5 g/L左右時(shí)達(dá)到極值，之后變化不大。這可能是由于鵝骨中的蛋白質(zhì)在胰蛋白酶、胃蛋白酶加酶量均為1.5 g/L時(shí)水解基本完全，因此胃蛋白酶加酶量為1.5 g/L左右為最佳。

2.2.2 胃蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)CS提取率的影響

圖2 胃蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)CS提取率的影響Fig. 2 Effect of hydrolysis time on extraction yield of CS

由圖2可知，隨著胃蛋白酶酶解時(shí)間的增加，CS提取率逐漸增大，而在酶解4 h后CS提取率基本沒(méi)有變化，因此酶解時(shí)間4 h為最佳。

圖3 胃蛋白酶酶解溫度對(duì)CS提取率的影響Fig. 3 Effect of hydrolysis temperature on extraction yield of CS

2.2.3 胃蛋白酶酶解溫度對(duì)CS提取率的影響由圖3可知，CS提取率隨胃蛋白酶酶解溫度的升高呈上升趨勢(shì)，但溫度超過(guò)45 ℃時(shí)開(kāi)始下降。由此可見(jiàn)，酶解溫度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)影響CS的提取率，這是由于胃蛋白酶在不同溫度條件下的酶解程度不一樣[29]。溫度過(guò)低時(shí)，溶液中分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)慢，酶沒(méi)有充分發(fā)揮作用；而溫度過(guò)高時(shí)，會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生鈍化效用，因此提取鵝全骨中的CS時(shí)，酶解溫度為45 ℃最佳。

2.2.4 胃蛋白酶酶解pH值對(duì)CS提取率的影響

圖4 胃蛋白酶酶解pH值對(duì)CS提取率的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis pH value on extraction yield of CS

由圖4可知，胃蛋白酶酶解pH值對(duì)CS提取率的影響較大，這是由于pH值的變化會(huì)影響溶液中電荷的分布，直接影響到酶解的效果，因此在酶解過(guò)程中應(yīng)盡量保持pH值的穩(wěn)定[30]。對(duì)鵝全骨中CS的提取來(lái)說(shuō)，酶解pH值為3.0時(shí)，其提取率最高。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及其方差分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析，確定酶解的最佳條件，試驗(yàn)方案與結(jié)果如表3所示。

表3 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Benhnken design and experimental results

將獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到胃蛋白酶加酶量（A）、酶解時(shí)間（B）、酶解溫度（C）和pH值（D）對(duì)CS提取率的二次多項(xiàng)式回歸模型方程：CS提取率=11.97＋1.18A＋0.77B－0.98C－0.31D＋0.65AB＋0.06AC＋0.83AD－1.18BC－0.41BD＋0.29CD－2.23A2－1.45B2－2.09C2－3.35D2。

對(duì)該回歸模型進(jìn)行方差分析，并對(duì)模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。由表4可知：模型P＜0.01，表明響應(yīng)回歸模型達(dá)到了極顯著水平；失擬項(xiàng)P=0.065 2＞0.05，不顯著；模型一次項(xiàng)A、C極顯著，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2極顯著，一次項(xiàng)B、交互項(xiàng)AD、BC顯著，其余不顯著；校正決定系數(shù)R2Adj為0.858 2，變異系數(shù)為10.97%，大于4%，表明該模型有適當(dāng)?shù)男盘?hào)響應(yīng)；預(yù)測(cè)復(fù)相關(guān)系數(shù)=0.732 6，和校正相關(guān)系數(shù)=0.858 2基本符合。上述數(shù)據(jù)表明，得到的模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合較好，可直接利用該模型得到胃蛋白酶提取鵝全骨中CS的最佳工藝。

表4 模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 4 Analysis of variance and signifi cance test of regression model

2.3.2 各因素的交互作用分析

響應(yīng)面的三維圖反映出各試驗(yàn)因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響并非單一的線性關(guān)系，可根據(jù)其曲面的不同來(lái)判斷各試驗(yàn)因素交互作用的強(qiáng)弱。曲面越陡峭，表示因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著；曲面越平整，表示因素對(duì)響應(yīng)值的影響越不顯著。通過(guò)響應(yīng)面三維圖對(duì)胃蛋白酶加酶量（A）和pH值（D）及其交互作用、酶解溫度（C）和pH值（D）及其交互作用進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，并確定最佳工藝水平范圍。

圖5 胃蛋白酶加酶量和pH值對(duì)CS提取率交互作用的響應(yīng)曲面圖Fig. 5 Response surface plot showing the interactive effect of pepsin dosage and hydrolysis pH value on extraction yield of CS

由圖5可知，在酶解時(shí)間為6 h、酶解溫度為45 ℃時(shí)，當(dāng)胃蛋白酶酶解pH值較低時(shí)，CS提取率隨pH值的增大而升高，但當(dāng)pH值超過(guò)3時(shí)，CS提取率隨pH值的增大而降低。綜合分析，在試驗(yàn)正常水平范圍內(nèi)，胃蛋白酶加酶量和pH值分別在1.5～2.0 g/L和2.50～3.50范圍內(nèi)時(shí)，CS提取率可以達(dá)到最大值。

圖6 胃蛋白酶酶解溫度和pH值對(duì)CS提取率交互作用的響應(yīng)曲面圖Fig. 6 Response surface showing the interactive effect of hydrolysis temperature and pH value on extraction yield of CS

由圖6可知，在胃蛋白酶加酶量為1.5 g/L、酶解時(shí)間為6 h時(shí)，當(dāng)酶解溫度較低時(shí)，CS的提取率隨溫度的升高而增大，但當(dāng)酶解溫度超過(guò)45 ℃時(shí)，CS提取率隨著酶解溫度的升高而降低。綜合分析，在試驗(yàn)正常水平范圍內(nèi)，酶解溫度和pH值分別在40～45 ℃和2.50～3.50范圍內(nèi)時(shí)，CS提取率可以達(dá)到最大值。

2.3.3 最佳胃蛋白酶酶解提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)模型預(yù)測(cè)出胃蛋白酶酶解提取CS的最佳工藝為加酶量1.55 g/L、酶解時(shí)間6.42 h、酶解溫度42.14 ℃、pH值3.09，CS提取率的預(yù)測(cè)值為12.14%。為了操作方便，把驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的提取工藝調(diào)整為胃蛋白酶加酶量1.55 g/L、酶解時(shí)間6.4 h、酶解溫度42 ℃、pH值3.00，進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，得到的實(shí)際CS提取率為12.35%，與所預(yù)測(cè)的最優(yōu)值無(wú)明顯差異。

2.4 CS的定性

圖7 CS標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖Fig. 7 HPLC chromatogram of CS standard solution

由圖7～8可知，CS標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的CS在高效液相色譜圖中的出峰時(shí)間基本一致。在Waters E2695高效液相色譜儀分析軟件上進(jìn)行光譜匹配，匹配度達(dá)998.992，可確定提取物為CS。

圖8 樣品中CS的高效液相色譜圖Fig. 8 HPLC chromatogram of CS prepared in this study

3 結(jié) 論

以鵝全骨為原料提取CS，在堿提的基礎(chǔ)上，采用胰蛋白酶與胃蛋白酶進(jìn)行分步酶解，并對(duì)胃蛋白酶酶解的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到胃蛋白酶酶解的最佳工藝為加酶量1.55 g/L、酶解時(shí)間6.42 h、酶解溫度42.14 ℃、pH值3.09，提取率的預(yù)測(cè)值為12.14%。

對(duì)根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得出的最佳提取工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，鵝全骨中CS提取率為12%左右。本研究以鵝全骨為原料提取CS的新提取工藝，能更好地利用鵝加工的副產(chǎn)品——鵝全骨，提高資源的合理利用率，為現(xiàn)有CS生產(chǎn)企業(yè)提供了改進(jìn)的生產(chǎn)工藝，為提高產(chǎn)品質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益及下一步CS的提純提供了參考。