田 蕊,薩如拉,段曉霞,烏云達(dá)來

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

γ-氨基丁酸(Gamma-Amino-Butyric Acid,GABA)是一種存在于自然界的非蛋白氨基酸,又稱氨酪酸,是人體中樞神經(jīng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì),是神經(jīng)抑制性氨基酸,具有降血壓[1]、改善和治療糖尿病[2]、治療癲癇[3]、抗癌[4]、抗疲勞、改善腦功能、增強(qiáng)記憶力[5,6]以及抗壓等作用[7],是對(duì)人體起重要抑制作用的一種氨基酸[8]。隨著年齡的增長(zhǎng),精神壓力的加大使得人體自身積累GABA能力下降,而從日常的飲食中補(bǔ)充GABA則能有效的改善這種狀況[9]。因此,研究富含GABA的功能性食品就顯得尤為重要[10]。2017年周中凱等[11]對(duì)富GABA米糠與普通米糠進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)富GABA米糠能有效抑制大鼠過氧化水平,對(duì)肝損傷起到了一定的保護(hù)作用。

目前,GABA的生產(chǎn)方式有化學(xué)合成法、植物富集法以及微生物發(fā)酵法[12-13],化學(xué)合成法制備得到GABA轉(zhuǎn)化率高、純度高,但由于反應(yīng)條件劇烈,且反應(yīng)產(chǎn)物的安全性存在爭(zhēng)議,故不常用于食品加工中[14]。目前植物富集法已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用,2014年邊偉等[15]通過對(duì)桑茶進(jìn)行研究，得到一株高產(chǎn)GABA的菌株，其GABA含量高達(dá)3.322 mg/g,且桑茶滋味品質(zhì)較好。與植物富集法不能大量富集GABA,工藝復(fù)雜且成本高等缺點(diǎn)相比,微生物發(fā)酵法具有安全性高、操作簡(jiǎn)單、成本低、工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),使其在食品加工中得到更加廣泛的應(yīng)用[16]。研究表明,目前能夠用于生產(chǎn)GABA的微生物包括大腸桿菌[17]、曲霉[18]以及乳酸菌[19]。其中乳酸菌作為一種對(duì)人體幾乎無害的菌群,成為了人們爭(zhēng)相研究的對(duì)象。20世紀(jì)80年代中后期,日本的科研人員發(fā)現(xiàn)鮮茶葉可以在厭氧的條件下積累大量GABA[20];2013年李亞莉等[21]在普洱茶發(fā)酵過程中添加優(yōu)勢(shì)菌種,使GABA產(chǎn)量提高3～25倍。微生物發(fā)酵法制備GABA的研究大部分以常見發(fā)酵食品為研究對(duì)象,例如:泡菜、發(fā)酵米粉[22]、酸菜[23]、豆乳[24]等。而具有調(diào)理腸道[25]、增強(qiáng)免疫力[26]、輔助治療心血管疾病、肺部疾病以及消化道疾病等醫(yī)療保健作用的酸馬奶[27],卻極少得到人們的重視。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)酸馬奶中分離得到的17株乳酸菌進(jìn)行篩選,得到一株產(chǎn)GABA菌株,對(duì)其進(jìn)行生理生化及分子生物學(xué)鑒定,并對(duì)菌株進(jìn)行紫外誘變進(jìn)一步提高GABA產(chǎn)量,為今后實(shí)現(xiàn)GABA的功能性食品研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)菌株 供試菌株共17株(由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品質(zhì)量與安全教研室前期從酸馬奶中分離的菌株);衍生化試劑PITC和γ-氨基丁酸(含量≥99%) 美國(guó)Sigma公司;乙腈、乙酸和三乙胺 色譜純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;谷氨酸鈉、無水乙酸鈉、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖 分析純,天津市大茂化學(xué)試劑有限公司;水為超純水。

1260高效液相色譜儀 Agilent公司;ZHJHZ-C1214雙人單面凈化工作臺(tái) 上海志誠(chéng)公司;YM-50高壓滅菌鍋 上海博訊公司;5804R高速離心機(jī)、Eppendorf公司;2710PCR儀 ABI公司;FR980凝膠成像儀 上海復(fù)日科技有限公司;LRH-150系列恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 培養(yǎng)基配制:脫脂乳培養(yǎng)基:脫脂乳粉10.0 g、酵母粉0.1 g、蒸餾水90 mL,121 ℃、7 min滅菌備用。

液體MRS培養(yǎng)基:檸檬酸二胺0.2%,酵母粉0.5%,葡萄糖2%,吐溫-80 0.1%,牛肉浸膏0.5%,乙酸鈉0.5%,磷酸氫二鉀0.2%,蛋白胨1%,硫酸鎂0.058%,硫酸錳0.025%,pH6.2～6.4,121 ℃,滅菌15 min。

固體培養(yǎng)基:液體MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,加1%的瓊脂,121 ℃,滅菌15 min[28]。

液體GYP培養(yǎng)基:酵母粉1%,蛋白胨0.5%,葡萄糖1%,醋酸鈉0.2%,硫酸鎂0.02%,硫酸錳0.0001%,硫酸亞鐵0.0001%,氯化鈉0.0001%,自然pH[28],121 ℃,滅菌15 min。

GYP發(fā)酵培養(yǎng)基:液體GYP培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加1%的谷氨酸鈉,pH6.8[12],121 ℃,滅菌15 min。

1.2.2 產(chǎn)GABA菌種的篩選 將17株供試菌株接種于脫脂乳培養(yǎng)基活化1代后,接種于MRS液體培養(yǎng)基中活化2代,以4%的接種量接種于5 mL GYP發(fā)酵培養(yǎng)基中,置于37 ℃恒溫箱、培養(yǎng)48 h。取出搖勻振蕩,取5 mL發(fā)酵好的菌液,8000 r/min離心10 min,取上清液測(cè)定其GABA含量[29],從而篩選出GABA產(chǎn)量較高的菌株,并將其作為出發(fā)菌株進(jìn)行生理生化及分子生物學(xué)鑒定。

1.2.3 供試菌株產(chǎn)GABA能力的測(cè)定 高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:配制濃度為0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mmol/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液,準(zhǔn)確吸取GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液各200 μL分別置于1.5 mL離心管中;加入三乙胺乙腈溶液100 μL、PITC乙腈溶液100 μL至每個(gè)離心管中,混勻,室溫放置(25 ℃)1 h;然后加入正己烷400 μL至每個(gè)離心管,振搖后放置10 min;取下層溶液(PTC-AA),用0.45 μm針式過濾器過濾;取濾液200 μL,加800 μL水稀釋,搖勻,放入進(jìn)樣瓶中用高效液相色譜法進(jìn)行GABA測(cè)定,每個(gè)濃度做兩個(gè)平行樣測(cè)定,根據(jù)測(cè)定結(jié)果以GABA濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制GABA曲線[12,30]。

樣品GABA含量的測(cè)定:取200 μL 1.2.2中得到的發(fā)酵液根據(jù)上述衍生化方法處理后測(cè)定其GABA峰面積,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的GABA含量。

1.2.4 出發(fā)菌株生理生化及分子生物學(xué)鑒定

1.2.4.1 出發(fā)菌株生理生化鑒定 在37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h的MRS平板中挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色,再對(duì)菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn),包括過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)、石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)以及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)[31]。

1.2.4.2 出發(fā)菌株分子生物學(xué)鑒定 根據(jù)基因組DNA提取試劑盒步驟提取菌株43的基因組DNA,用于16S rDNA的PCR擴(kuò)增正向引物(P1):5′-AAGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′;反向引物(P2):5′-CTACGGCTACCTTGTACGA-3′。50 μL反應(yīng)體系:Mix 25 μL,模板DNA 1 μL,P1 2 μL,P2 2 μL,ddH2O 20 μL;PCR反應(yīng)程序:94 ℃ 2 min;94 ℃ 45 s、55 ℃ 50 s、72 ℃ 2 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃延伸60 min。16S rDNA序列測(cè)序由上海生工生物技術(shù)公司完成。將菌株的16S rDNA序列與GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行BLAST同源性檢索,再利用MEGA5.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[31]。

1.2.5 紫外誘變篩選GABA高產(chǎn)菌株

1.2.5.1 菌懸液的制備 將出發(fā)菌株按4%的接種量接種于10 mL GYP發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,取出用振蕩器搖勻后8000 r/min離心10 min,棄上清液,加生理鹽水洗滌兩次,再倒入10 mL生理鹽水搖均后備用。

1.2.5.2 最佳紫外誘變條件的選擇 將10 mL制備好的菌懸液放置在培養(yǎng)皿中置于黑暗條件下,選擇30 W紫外燈進(jìn)行誘變育種,在距離紫外燈30 cm處分別對(duì)其照射10、20、30、40、50、60、80、100 s,靜置30 min,將紫外處理后的菌液進(jìn)行梯度稀釋至10-6、10-7、10-8后,涂布培養(yǎng)并計(jì)算致死率,選取致死率為80%～90%之間的時(shí)間為最佳誘變時(shí)間[23]。

致死率(%)=(誘變前的菌落總數(shù)-誘變后的菌落總數(shù))/誘變前的菌落總數(shù)×100[32]

1.2.5.3 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性研究 對(duì)篩選出的目的菌株進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)10代,并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行GABA含量的測(cè)定,觀察其遺傳穩(wěn)定性[33]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件對(duì)1.2.5篩選出的突變菌株以及GABA高產(chǎn)菌株的產(chǎn)GABA能力遺傳穩(wěn)定性代次之間的顯著性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

高效液相色譜法分辨率高于其他色譜法,重復(fù)性高、速度快、時(shí)間短,十幾分鐘到幾十分鐘就可完成,自動(dòng)化程度高,分析精確度高[34-35]。其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of γ-aminobutyric acid

從圖1可知,在GABA標(biāo)曲濃度0.5～2.5 mmol/L之間,其線性方程為y=1665.7x-225.39,R2為0.9992,表明濃度與峰面積之間的線性關(guān)系良好。

對(duì)17株供試菌株進(jìn)行產(chǎn)GABA菌株的篩選,最終得到一株具有產(chǎn)GABA能力較好的菌株43,其產(chǎn)量為0.731 g/L(見表1),故選擇菌株43為出發(fā)菌株并對(duì)其進(jìn)行生理生化及分子生物學(xué)鑒定。

表1 17株產(chǎn)GABA乳桿菌菌株測(cè)定結(jié)果Table 1 Result of 17 strains of GABA producing lactobacillus

2.2 出發(fā)菌株生理生化及分子生物學(xué)鑒定

2.2.1 出發(fā)菌株生理生鑒定 菌株43的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示,菌株43為革蘭氏陽(yáng)性菌;接觸酶實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)以及硫化氫實(shí)驗(yàn)均呈陰性;石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性,石蕊牛奶凝固且有乳清析出。菌株43 API 50 CH糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3,將結(jié)果輸入apiweb分析軟件中進(jìn)行鑒定,其鑒定結(jié)果為菌株43與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的相似度為99.9%。結(jié)合表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將菌株初步鑒定為植物乳桿菌。

表3 菌株43 API 50 CH糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 API 50 CH results of sugar fermentation of strain 43

表2 菌株43生理生化實(shí)驗(yàn)Table 2 Physiological and biochemical properties of strain 43

2.2.2 16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果 菌株43 16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

圖2 菌株43 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 16S rDNA PCR amplification of stain 43

由圖2可知,產(chǎn)GABA乳酸菌菌株43的16S rDNA基因序列在1000 bp左右出現(xiàn)了特異性熒光條帶,其能滿足后續(xù)的測(cè)序要求。

2.2.3 菌株43的序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制 測(cè)序結(jié)果表明,出發(fā)菌株43的16S rDNA基因序列共計(jì)1470 bp,對(duì)其進(jìn)行同源性分析可知其為植物乳桿菌,并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知的11株植物乳桿菌基因序列進(jìn)行對(duì)比,并用MEGA5.0進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制[31],如圖3所示。結(jié)果表明出發(fā)菌株43與植物乳桿菌的同源性為95%,且處于一個(gè)分支上,由此進(jìn)一步證明,菌株43為植物乳桿菌。

圖3 菌株43的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain 43

2.3 紫外誘變篩選目的菌株

2.3.1 最佳紫外誘變條件的選擇 紫外誘變時(shí)間與菌株43致死率的關(guān)系如圖4所示,選擇致死率在80%～90%的范圍為最佳誘變時(shí)間[23],由圖4可知,30、40 s的致死率分別為87%、90%,正突變率分別是33.3%和53.3%,根據(jù)正突變率最終選擇40 s作為最佳誘變時(shí)間。

圖4 紫外誘變致死率曲線Fig.4 Lethality curve of strain 43 under UV mutagenesis

2.3.2 紫外誘變結(jié)果 以菌株43為出發(fā)菌株進(jìn)行誘變,在距離30 W紫外燈30 cm處誘變40 s,進(jìn)行7輪的紫外誘變處理,經(jīng)初篩選出28株突變株進(jìn)行復(fù)篩,其中5株產(chǎn)GABA的含量較高,結(jié)果由表4可知,菌株43-48與原始菌株43無顯著差異(p>0.05),菌株43-18與顯著高于菌株43(p<0.05),而其他43-3、43-7、43-23三株菌株的GABA產(chǎn)量極顯著高于菌株43(p<0.01),其中43-7的產(chǎn)量最高,為1.051 g/L,比原始菌株的GABA產(chǎn)量提高了43.6%。

表4 突變菌株發(fā)酵液中GABA 產(chǎn)量Table 4 GABA production in mutant strains broth

2.3.3 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性研究 對(duì)GABA高產(chǎn)菌株43-7進(jìn)行遺傳穩(wěn)定試驗(yàn),連續(xù)傳代培養(yǎng)10代,觀察其生長(zhǎng)情況并測(cè)定GABA含量,結(jié)果如表5所示,GABA高產(chǎn)菌株43-7產(chǎn)GABA的量穩(wěn)定,未出現(xiàn)回復(fù)突變;如表6分析結(jié)果顯示菌株43-7每代的GABA產(chǎn)量無顯著變化(p<0.05),說明該菌株均有較好的遺傳穩(wěn)定性。

表5 GABA高產(chǎn)菌株43-7遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 5 High-yield GABA strain 43-7 genetic stability experiment

表6 菌株43-7遺傳實(shí)驗(yàn)方差分析Table 6 Variance analysis of genetic testing for strain 43-7

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以酸馬奶樣品中分離得到的17株乳酸菌作為供試菌株,通過高效液相色譜法測(cè)定其GABA產(chǎn)量,從而篩選出一株產(chǎn)GABA能力較強(qiáng)的菌株,最終選擇菌株43為出發(fā)菌株,并對(duì)其進(jìn)行生理生化及分子生物學(xué)鑒定,將菌株43鑒定為植物乳桿菌。再以該菌為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變處理,紫外誘變的最佳條件為30 W的紫外燈下、照射距離為30 cm,照射40 s,經(jīng)7輪誘變和篩選得到一株高產(chǎn)GABA菌株43-7,其GABA含量為1.051 g/L,比原始菌株產(chǎn)量提高了43.6%,將菌株43-7連續(xù)傳代10代,每代的GABA產(chǎn)量無明顯差異,說明高產(chǎn)GABA菌株43-7遺傳穩(wěn)定性較好。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為規(guī)?；a(chǎn)功能性食品奠定了基礎(chǔ),也為GABA的發(fā)酵生產(chǎn)提供了參考意義。