朱愛萍 王 麗 李 清△

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2.湖北省十堰市人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

燈盞花素注射液是從菊科植物短葶飛蓬、燈盞花全株中提取分離所得的黃酮類有效成分，具有抗血栓形成、抗凝血、抗心肌缺血，改善微循環(huán)及血液流變性、增加腦血流量、提高機(jī)體耐缺氧能力等作用［1］。臨床用于治療腦出血所致后遺癥、腦供血不足、腦血栓、高黏脂血癥、心絞痛、冠心病等疾病［2］。有研究表明其可通過促進(jìn)血管新生、清除自由基而發(fā)揮急性腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用［3］。但在針對急性腦缺血/再灌注可能因凝血功能異常而發(fā)生如出血傾向、血栓形成或彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）等引起的血管內(nèi)皮損傷，以及與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮依賴性舒張功能相關(guān)因子如一氧化氮（NO）釋放及內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOs）基因表達(dá)等方面鮮有相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，本研究系統(tǒng)觀察了燈盞花素注射液對MCAO模型大鼠上述指標(biāo)的影響，分析其如何通過凝血酶激活途徑影響凝血功能，以及其對NO釋放及eNOs基因表達(dá)的影響，揭示其調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能、保護(hù)腦內(nèi)皮免受上述因素造成的損傷機(jī)制，以期為臨床用藥提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠60只，雄性，SBF級，體質(zhì)量180～190 g，實(shí)驗(yàn)動物由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供［許可證：SCXK（鄂）2017-0008］。

1.2 藥物與試劑 燈盞花素注射液（石藥銀湖制藥有限公司， 批號：Z17021942）；NO、eNOs檢測 ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號：H17023，H1724）；TXA2、t-PA及PAI試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：0173h40，0173h44，17006）；PGI2 檢測試劑盒（上海信裕生物科技有限公司量，批號16049）；TT、Xa和凝血酶活性熒光定量檢測試劑盒 （上海杰美基因醫(yī)藥科技有限，批號：E0722，E17110，E1627）。

1.3 造模與分組 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（按3.0 mL/kg劑量麻醉），注射水合氯醛后約5 min，針刺足底檢查麻醉效果，當(dāng)翻正反射及疼痛均消失時即可開始手術(shù)。大鼠取仰臥位，固定大鼠門齒，剃去頸胸部鼠毛后消毒，縱行切開頸正中皮膚（約2 cm），鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露左側(cè)頸總動脈，沿頸總動脈血管縱行鈍性分離出頸內(nèi)動脈及頸外動脈。結(jié)扎頸外動脈血管后剪斷，并用高頻電凝電刀夾閉血管止血，沿頸內(nèi)動脈向遠(yuǎn)心端分離出進(jìn)入顱內(nèi)的翼腭動脈，在頸內(nèi)動脈近心端下置一根手術(shù)線，然后分別用微動脈夾夾閉翼腭動脈遠(yuǎn)心端和頸內(nèi)動脈近心端，在緊靠頸內(nèi)動脈近心端備用手術(shù)線處用眼科剪剪一小口，取用0.9%氯化鈉注射液浸泡的備用栓線小心插入，當(dāng)栓線到達(dá)翼腭動脈微動脈夾夾閉處時，松開微動脈夾，緩慢推進(jìn)到標(biāo)記處，當(dāng)手感遇到阻力即可。此時栓線已到達(dá)willis環(huán)，不可再用力，否則可能刺破willis環(huán)造成蛛網(wǎng)膜下腔出血，栓線阻斷供血90 min后抽出以恢復(fù)大腦血流。分層縫合頸部皮下組織和肌肉、消毒。待大鼠清醒后，參照Longa 5級4分制神經(jīng)學(xué)評分進(jìn)行評分，評分在1~4分的大鼠為造成功。其中0分：為正常體征，大鼠清醒后未出現(xiàn)異常的神經(jīng)系統(tǒng)體征。1分：提起大鼠時右側(cè)上肢不能完全伸展。2分：提起大鼠時右前爪內(nèi)收并握緊爪子，行走時向右側(cè)旋轉(zhuǎn)。3分：行走時向?qū)?cè)完全傾倒，動物不能正常行走。分組：術(shù)后12 h，剔除造模后死亡及蛛網(wǎng)膜下腔出血的24只。選擇經(jīng)Longa神經(jīng)學(xué)評分符合急性腦缺血/再灌注損傷標(biāo)準(zhǔn)的36只成模大鼠，隨機(jī)均分為對照組、葉酸組和燈盞花素組。

1.4 給藥方法 各組均從尾靜脈注射給藥治療14 d（均每日1次），其中對照組按每只大鼠0.2 mL注射0.9%氯化鈉注射液，葉酸組按每只大鼠1 mg注射葉酸注射液，燈盞花素組按每只大鼠1 mg注射燈盞花素注射液。

1.5 標(biāo)本采集及檢測 1）治療第14日，采用Longa神經(jīng)學(xué)評分比較治療前后3組神經(jīng)功能恢復(fù)情況。2）剪斷大鼠尾部（約2 mm），迅速取500 μL靜脈血低溫凍存?zhèn)溆茫粩辔踩⊙笸瑫r記錄BT及CT時間。BT采用斷尾法記錄：斷尾取血用濾紙每15 s吸符尾尖溢出之血液，至出血停止時間即為BT時間。CT時間采用玻片法：在檢測BT的同時，用濾紙吸去第1滴血，將鼠尾靜脈血滴到玻片上（直徑約5 mm），間隔15 s用大頭針從邊緣向內(nèi)側(cè)輕挑1次，以出現(xiàn)纖維蛋白絲為CT時間。3）BT及CT時間記錄完后，斷頭法處死大鼠，迅速取開顱，小心錄取腦組織，分離出腦缺血區(qū)組織，采用HE染色法檢測病理學(xué)改變。4）取willis動脈，采用發(fā)色底物法檢測willis動脈環(huán)內(nèi)皮組織t-PA及PAI活性。5）采用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測大鼠willis動脈環(huán)NO、eNOs及血漿PGI2含量；采用放射免疫法測定TXA2含量。6）取低溫凍存?zhèn)溆玫撵o脈血，采用凝血因子生成實(shí)驗(yàn)觀察大鼠靜脈血內(nèi)/外源性凝血因子Xa活性。7）采用發(fā)色底物法測定血漿凝血酶含量及TT。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，對于經(jīng)方差分析符合正態(tài)分布的采用t檢驗(yàn)，方差不齊采用校正t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組 t-PAT、PGI2、TXA2、PAI、NO 及 eNOs 水平比較 見表1。與對照組比較，葉酸組NO及eNOs水平均顯示提高，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。葉酸對 Tt-PAT、PGI2、TXA2、PAI水平無明顯影響，故葉酸組 t-PAT、PGI2、TXA2、PAI水平與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。燈盞花素組t-PAT活性和PGI2含量提高，而TXA2含量、PAI活性、內(nèi)/外源性凝血因子Xa和凝血酶含量均降低，與對照組和葉酸組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表 1 各組 t-PAT、PGI2、TXA2、PAI、NO 及 eNOs比較（±s）

表 1 各組 t-PAT、PGI2、TXA2、PAI、NO 及 eNOs比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與葉酸組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n t-PAT（IU/mL）PGI2（ng/mL）PAI（IU/mL）TXA2（ng/L）NO（ng/mL）eNOs（pg/mL）對照組 12葉酸組 12 1.69±0.54 56.37±7.25 12.59±2.31 1.73±0.48 58.24±6.51 12.05±2.73 197.54±12.76 194.28±20.14 8.14±0.79* 6.27±0.53*19.24±2.05*△ 10.86±1.03*△燈盞花素組 122.86±0.75*△ 80.50±7.29*△ 8.94±0.92*△130.57±16.69*△18.28±2.72△ 9.69±0.91△

2.2 各組凝血功能比較 見表2。葉酸對內(nèi)/外源性凝血因子Xa和凝血酶生成、CT、TT及BT均無明顯影響，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。燈盞花素內(nèi)/外源性凝血因子Xa、凝血酶生成減少，CT、TT及BT延長，與對照組和葉酸組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 各組治療前后Longa神經(jīng)學(xué)評分比較 見表3。治療前后對照組Longa神經(jīng)學(xué)評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。葉酸組Longa神經(jīng)學(xué)評分明顯降低，與治療前和對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。燈盞花素組Longa神經(jīng)學(xué)評分顯著降低，與對照組、葉酸組和治療前比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組凝血功能比較（±s）

表2 各組凝血功能比較（±s）

組 別 n CT（s） BT（s） TT（s） 凝血酶（U）內(nèi)源性凝血因子 Xa（pg/mL）外源性凝血因子 Xa（pg/mL）對照組 12葉酸組 12 81.27±7.34 402.97±59.81 179.29±20.13 82.07±9.69 406.25±60.34 181.04±19.67 15.36±2.71 16.73±1.95 80.97±10.81 79.34±6.57 82.23±7.96 77.85±6.26燈盞花素組 12102.48±19.55*△ 549.29±47.58*△ 221.97±26.55*△11.58±2.80*△67.34±6.01*△ 63.54±7.81*△

表3 各組治療前后Longa神經(jīng)學(xué)評分比較（分，±s）

表3 各組治療前后Longa神經(jīng)學(xué)評分比較（分，±s）

與本組治療前比較，#P＜0.05；與對照組治療后，*P＜0.05；與葉酸組治療后比較，△P＜0.05

組 別 n 治療前 治療后對照組 12 4.27±0.35 4.41±0.27葉酸組 12 4.23±0.37 2.96±0.21*#燈盞花素組 12 4.30±0.31 1.85±0.16*△#

2.4 各組腦組織病理檢查結(jié)果 見圖1。腦缺區(qū)HE染色顯示，對照組腦缺區(qū)可見神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、胞核溶合，出現(xiàn)壞死灶。葉酸組HE染色未見壞死灶，但有少量神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、胞核溶合現(xiàn)象較對照組明顯少。燈盞花素組細(xì)胞排列紊亂及溶合現(xiàn)象較對照組明顯好轉(zhuǎn)且優(yōu)于葉酸組。

圖1 各組腦組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE染色，400倍）

3 討 論

血管活性物質(zhì)NO為機(jī)體重要的舒血管因子，可通過血管內(nèi)皮細(xì)胞自分泌、內(nèi)分泌和旁分泌等不同途徑分泌，參與調(diào)節(jié)血管緊張性、對血栓形成、平滑肌細(xì)胞增殖、動脈粥樣硬化、白細(xì)胞黏附及血管壁炎癥反應(yīng)均具有抑制作用［4］。NO主要由激活的eNOs催化產(chǎn)生，故兩者存在著正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，eNOs活性增強(qiáng)可崔化NO合成與釋放，而NO增多有利于抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞活化和血小板聚集［5］。NO在缺血/再灌注中發(fā)揮著雙重調(diào)節(jié)機(jī)制，NO釋放減少會導(dǎo)致血管內(nèi)皮依賴性舒張功能降低，從而增加腦梗死及缺血性腦卒中的發(fā)生，而NO釋放過多又會引起平滑肌細(xì)胞過度增殖及血小板的黏附降低，這會增加腦出血的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［6］。由此可見，NO在腦梗死或腦出血的病理過程中均發(fā)揮著重要作用，而調(diào)節(jié)eNOs基因表達(dá)在維持血管內(nèi)皮功能方面具有重要的研究價(jià)值。腦缺血/再灌注損傷是急性腦血管病發(fā)生與發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)，會影響到纖溶系統(tǒng)的激活通路，包括促凝活性增強(qiáng)、抗凝活性減弱。腦研究表明，急性腦缺血/再灌注損傷是造成顱腦損傷的重要誘因，而顱腦損傷可引起如DIC等凝血功能紊亂等凝血功能異常現(xiàn)象，這也是造成顱腦損傷者死亡的主因［7］。因DIC的出血及血栓栓塞常引起廣泛的血管內(nèi)皮損傷引，其造成的多器官功能障礙綜合征將導(dǎo)致患者死亡，故防止DIC，保護(hù)血管內(nèi)皮在防治心腦血管性疾病方面具有重要意義。機(jī)體凝血功能由多因素參與，其中血小板微粒體中前列腺素H2經(jīng)血栓素A合酶的催化下產(chǎn)生TXA2合成，TXA2釋放后可激活血小板并使其聚集，具有強(qiáng)烈促進(jìn)血管收縮作用，在組織損傷時可減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合［8］。PGI2也是由血管壁內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放，具有舒張血管及抗血小板聚集的生物活性，在炎癥反應(yīng)中可產(chǎn)生炎性疼痛［9］。在生理狀態(tài)下，組織或血漿或PGI2和TXA2保持動態(tài)平衡，當(dāng)其平衡失調(diào)（PGI2生成減少或TXA2合成增多）均可能導(dǎo)致血小板聚集、血管出現(xiàn)痙攣收縮，這是血栓形成根本原因之一［10］。因此，測定PGI2和TXA2在血漿或組織中的濃度對臨床血栓性疾病的發(fā)病預(yù)測及療效判斷均具有重要的意義［11］。t-PA是一種絲氨酸蛋白酶，可以將纖溶蛋白酶原轉(zhuǎn)化為纖溶蛋白酶，從而促進(jìn)纖維蛋白溶解，t-PA由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成、分泌的一種單鏈糖蛋白，對纖維蛋白有高度親和力，在釋放入血液后將酪氨酸纖溶酶原全成為纖溶酶、從而降解纖維蛋白原和凝血因子［12］。因此，提高t-PA活性、降低PAI活性或增加PGI2生成均可改善血管內(nèi)皮功能，調(diào)節(jié)機(jī)體凝血與纖溶功能［13］。

葉酸注射液為強(qiáng)力血管保護(hù)劑，可增強(qiáng)eNOs活性，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放NO，增強(qiáng)血管舒張功能［14］。在本研究中作為陽性對照，其可顯著提高eNOs活性并促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放NO，葉酸組NO、eNOs均較對照顯著升高。而燈盞花素注射液也具有葉酸促進(jìn)eNOs和NO的功能，燈盞花素組NO、eNOs均顯著升高。另外，燈盞花素注射液還可提高t-PAT活性和PGI2含量、降低TXA2合成、抑制PAI活性的作用。在治療14 d后，燈盞花素組t-PAT活性和PGI2含量提高，而TXA2含量和PAI活性明顯降低，與對照組和葉酸組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。燈盞花素組CT、TT和BT較對照組和葉酸組延長，內(nèi)/外源性凝血因子Xa和凝血酶含量降低，對凝血功能產(chǎn)生明顯的影響。

以上觀察結(jié)果表明，燈盞花素注射液可能通過提高eNOs活性來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞合成NO，再通過NO發(fā)揮擴(kuò)血管效應(yīng)，這一作用與血管保護(hù)劑葉酸極其相似。另外，燈盞花素對損傷組織凝血功能也產(chǎn)生明顯的影響，其機(jī)制與抑制PAI活性、提高t-PAT活性并促進(jìn)PGI2生成、使內(nèi)/外源性凝血因子Xa和凝血酶生成減少有關(guān)。燈盞花素可降低TXA2合成，使血小板激活及聚集受到抑制而不能發(fā)揮促血管收縮作用，可降低血栓產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)，這一作用的直按結(jié)果是延長CT、TT及BT時間。這與蘇延玲等［15-16］研究結(jié)果高度一致。

綜上所述，燈盞花素注射液具有保護(hù)急性腦缺血/再灌注損傷模型大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、防止凝血功能紊亂的作用。經(jīng)腦區(qū)HE染色還發(fā)現(xiàn)燈盞花素注射液對急性腦缺血/再灌注損傷模型大鼠腦缺區(qū)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，燈盞花素組細(xì)胞排列紊亂及溶合現(xiàn)象較對照組明顯好轉(zhuǎn)且優(yōu)于葉酸組，在改善Longa神經(jīng)學(xué)評分方面較葉酸強(qiáng)，說明燈盞花素注射液具有改善腦損傷神經(jīng)功能的作用。從以上觀察結(jié)果來看，燈盞花素注射液的抑凝血效應(yīng)明顯，這對減少急性腦缺血/再灌注后血栓形成產(chǎn)生積極的作用，在臨床治療急性腦梗死后，降低血栓形成、保護(hù)血管內(nèi)皮方面產(chǎn)生了積極的治療作用。