石 磊 韓亞飛 賈博宜 孫中美 原文靜 丁龐華 郭 一 謝添弘 陳 晨 李軍祥△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種由基因、免疫、心理、環(huán)境等多因素參與引起的腸道疾病，臨床以黏液膿血便、腹痛、里急后重為主［1］。目前多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為由機(jī)械、化學(xué)、生物和免疫屏障組成的腸屏障遭到破壞在UC發(fā)病中起到了重要的作用［2］。5-氨基水楊酸制劑為輕中度UC的主要治療藥物，但在使用中發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)緩解效率較低、患者依從性差，更無法緩解患者腹部怕涼、手足不溫、體質(zhì)量下降等癥狀。中醫(yī)藥辨證論治用藥靈活，在減輕UC病情、預(yù)防復(fù)發(fā)方面具有較明顯的優(yōu)勢［3］，而這可能與復(fù)方多靶點(diǎn)調(diào)控相關(guān)機(jī)制有關(guān)。緊密連接是保證機(jī)械屏障正常功能的基本結(jié)構(gòu)，Occludin蛋白作為其中的重要組成部分，在維系上皮細(xì)胞極性、維持緊密連接完整結(jié)構(gòu)方面起關(guān)鍵作用［4］。目前尚未見到從溫中健脾、清熱燥濕角度探討扶正祛邪法通過改善Occludin蛋白表達(dá)發(fā)揮療效的相關(guān)報(bào)道。因此本研究擬從溫中健脾、清熱燥濕角度立法，研究代表方清腸溫中方對寒熱錯(cuò)雜證UC大鼠及Occludin蛋白的作用影響，為溫中健脾、清熱燥濕法治療潰瘍性結(jié)腸炎（寒熱錯(cuò)雜證）臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，為潰瘍性結(jié)腸炎的中醫(yī)藥治療提供新的治療思路?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級健康雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量（200±20）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動(dòng)物房，12 h/12 h光照/黑暗循環(huán)，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，自由飲食飲水。

1.2 藥物與試劑 清腸溫中浸膏方 （黃連6 g，炮姜10 g，三七6 g，木香6 g，炙甘草6 g等）由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供。陽性對照中藥烏梅丸（烏梅16 g，細(xì)辛 6 g，干姜 10 g，黃柏 6 g，桂枝 6 g，黃連 16 g，當(dāng)歸 4 g，附子 6 g，川椒 4 g，人參 6 g），購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院顆粒劑藥房。陽性對照西藥美沙拉秦緩釋顆粒（艾迪莎，國藥準(zhǔn)字H20143164），購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥房；5%TNBS（w/v）（P2297）購自美國Sigma公司。4%多聚甲醛、無水乙醇購自中農(nóng)博信（北京）科技有限公司；Anti-Occludin（ab31721）抗體購自美國Abcam公司。

1.3 分組與造模 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法將70只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、清腸溫中方高劑量組（2.0 g浸膏/kg）、清腸溫中方中劑量組（1.0 g 浸膏/kg）、清腸溫中方低劑量組（0.5 g 浸膏/kg）、美沙拉秦組（400 mg/kg）和烏梅丸組（8.4 g生藥/kg）共7 組，每組 10 只。 采用 2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）/無水乙醇改良復(fù)合法復(fù)制UC模型［5］。除空白組外，所有大鼠禁食不禁水12 h，10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射以麻醉大鼠，將石蠟油浸潤嬰兒10 cm圓頭灌腸管，由肛門緩慢插入8 cm，將終濃度33.3%無水乙醇的 TNBS（100 mg/kg）溶液0.6mL一次性于 1 min內(nèi)緩慢推注入內(nèi)，每只大鼠使用新灌腸管。保持仰臥位15 min后，放回籠內(nèi)棉花保暖至清醒，共3 d，每日1次。

1.4 給藥方法 實(shí)驗(yàn)第4日起，除空白組外，所有大鼠連續(xù)10 d以相應(yīng)藥物灌胃干預(yù)（1 mL/100 g），清腸溫中浸膏方高、中、低劑量組分別以2.0 g浸膏/kg（臨床患者2倍用量）、1.0 g浸膏/kg（臨床患者用量）、0.5 g浸膏/kg（臨床患者0.5倍用量）；美沙拉秦組以400 mg/kg（臨床患者用量）；模型組以蒸餾水灌胃。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 實(shí)驗(yàn)期間每日記錄大鼠體質(zhì)量，觀察一般情況和便質(zhì)，化驗(yàn)便潛血。實(shí)驗(yàn)第14日以10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，在裝有碎冰的培養(yǎng)皿中迅速進(jìn)行全結(jié)腸截取，將骨盆剪開徹底暴露盆腔，從肛門到膨大的回盲部全部取出，于PBS緩沖液中迅速涮洗并縱向剖開，根據(jù)CDMI評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。分離遠(yuǎn)端結(jié)腸（距肛門10 cm）2 cm，于4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，片厚4 μm，抗原修復(fù)后采用DAB顯色法免疫組化染色觀察Occludin蛋白表達(dá)。采用Image J軟件（1.37c NIH，USA）對染色結(jié)果進(jìn)行分析計(jì)算，平均光密度值（AOD＝IntDen/Area）表示目標(biāo)蛋白的具體染色情況。

1.6 觀察指標(biāo) 1）疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）［6］。 體質(zhì)量下降率：無下降0分；1%～5%記1分；5%～10%記2分；10%～15%記3分；大于15%記4分。便質(zhì)：正常0分，稀軟便2分；水樣便4分；便潛血：陰性0分；陽性2分；肉眼血便 4 分。 2）結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）［3］。 0分為無損傷；1分為無潰瘍；2分為腸壁變厚，無潰瘍；3分為有潰瘍，直徑＜1 cm；4分為有潰瘍，直徑＞1 cm，腸管與周圍組織無粘連；5分為有潰瘍，直徑＞1 cm，腸管與周圍組織有粘連。3）結(jié)腸組織病理學(xué)評分［4］。炎細(xì)胞浸潤：0分為無浸潤；1分為輕度；2分為中度；3分為重度。肉芽腫：0分為無；1分為輕度；2分為中度；3分為重度。病變深度：0分為黏膜層；1分為黏膜下層；2分為肌層；3分漿膜層。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS22.0（IBM，USA）統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，方差齊用LSD法，不齊用T2法。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料及計(jì)數(shù)資料用中位數(shù) （四分位數(shù)間距）描述，用獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)的K-W檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組DAI分類及大鼠一般情況比較 模型復(fù)制期間，除空白組大鼠外，均出現(xiàn)潛血陽性情況，后期逐漸出現(xiàn)血便表現(xiàn)并持續(xù)天數(shù)較長，可同時(shí)伴有糞便不成形或淡黃色黏液果膠形狀，癥狀持續(xù)至停藥后2~3 d。嚴(yán)重者肛門因便血量大、血液凝固后肛周皮毛潮濕、色黑，大鼠精神狀態(tài)低下，蜷縮抱團(tuán)，部分大鼠可見不自主顫栗現(xiàn)象。結(jié)合下利膿血、肛周潮濕以及畏寒抱團(tuán)的大體癥狀，考慮該方法復(fù)制的大鼠UC模型，符合寒熱錯(cuò)雜證。

隨后清腸溫中方中劑量組、美沙拉秦組和烏梅丸組大鼠逐漸呈現(xiàn)好轉(zhuǎn)情況，血便減少或消失，糞便逐漸成形，一般狀態(tài)較前好轉(zhuǎn)，食欲增加。體質(zhì)量變化率方面，幾組之間尚不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。便潛血和便質(zhì)情況上，模型組評分均明顯高于空白組（P＜0.01）；而與模型組比較，清腸溫中方中劑量、美沙拉秦和烏梅丸組大鼠評分均有所降低（P＜0.05），以上結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)期間空白組大鼠無死亡，模型組死亡4只，清腸溫中方高、低劑量組各死亡3只，清腸溫中方中劑量組、美沙拉秦組和烏梅丸組各死亡2只。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)DAI分類評分表［中位數(shù)（四分位數(shù)間距）］

2.2 各組大鼠日均體質(zhì)量比較 見表2。隨著模型復(fù)制的進(jìn)行，所有造模大鼠體質(zhì)量均呈明顯下降，且造模期間每組均有大鼠死亡，體質(zhì)量下降趨勢持續(xù)至造模停藥后2~3 d。隨著藥物干預(yù)治療日期的延長，除模型組外其余大鼠食欲較前好轉(zhuǎn)，體質(zhì)量均能有所增加，死亡情況也明顯少于模型組。模型組大鼠體質(zhì)量持續(xù)下降，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)體質(zhì)量較空白組明顯減輕（P＜0.01）。清腸溫中方中劑量組、烏梅丸組大鼠與模型組相比，體質(zhì)量增長最明顯（P＜0.01），美沙拉秦組體質(zhì)量也有所增加（P＜0.05）。

2.3 各組Occludin蛋白表達(dá)比較 免疫組化染色后可以發(fā)現(xiàn)（圖1），空白組大鼠結(jié)腸組織表達(dá)大量Occludin蛋白，且表達(dá)位置主要位于細(xì)胞膜，模型組由于腸道結(jié)構(gòu)紊亂消失，與空白組比較，Occludin蛋白表達(dá)也明顯減少（P＜0.01）。經(jīng)藥物干預(yù)后，與模型組相比，清腸溫中方中劑量組和美沙拉秦組能明顯上調(diào)Occludin表達(dá)（P＜0.01），其余各組也能使該蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），陽性染色Occludin蛋白平均光密度值見表2。

表2 各組大鼠日均體質(zhì)量、結(jié)腸Occludin蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠日均體質(zhì)量、結(jié)腸Occludin蛋白表達(dá)比較（±s）

組 別 n空白組 10模型組 6日均體質(zhì)量（g） AOD（平均光密度值）347.83±29.98 0.717±0.035 176.36±7.03* 0.303±0.025*高劑量組 7 248.26±7.91 0.513±0.021△中劑量組 8 270.92±26.22△△ 0.613±0.045△△低劑量組 7 250.76±24.51 0.510±0.036△美沙拉秦組 8 268.22±34.82△ 0.603±0.031△△烏梅丸組 8 279.52±41.37△△ 0.543±0.035△

圖1 各組大鼠結(jié)腸Occludin蛋白免疫組化圖（DAB染色，200倍）

2.4 各組結(jié)腸CMDI評分比較 見表3。模型組大鼠結(jié)腸高度粘連，脆性大，觸碰易出血和折斷，嚴(yán)重者與腹腔部分粘連，剖開腸道可見多處較大圓形斑片狀潰瘍，結(jié)腸明顯縮短，評分與空白組相比，明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比：美沙拉秦組能較明顯地改善潰瘍分布和大?。≒＜0.05），清腸溫中方各劑量組和烏梅丸組也均能減輕潰瘍，但水腫、腸道增厚情況未能明顯改善（P＞0.05）。

2.5 各組結(jié)腸組織病理學(xué)評分比較 見表3。HE染色觀察結(jié)腸組織（圖2）可見模型組腸道黏膜的4層結(jié)構(gòu)消失，隱窩結(jié)構(gòu)紊亂消失，伴大量中性粒細(xì)胞浸潤全視野，炎癥程度嚴(yán)重，評分與空白組比較明顯升高（P＜0.01）。清腸溫中方中劑量組和美沙拉秦組可見整齊的4層結(jié)構(gòu)?？梢娗逦碾[窩和較多規(guī)律分布的杯狀細(xì)胞，中性粒細(xì)胞浸潤以黏膜層為主，少有黏膜下層浸潤，偶見嗜酸性粒細(xì)胞，與模型組相比，評分明顯降低（P＜0.01）。其余各組均有好轉(zhuǎn)趨勢，組織學(xué)改變介于上述兩者情況之間，但與模型組比較，尚不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 各組大鼠結(jié)腸CMDI評分、結(jié)腸組織病理學(xué)評分表［分，中位數(shù)（四分位數(shù)間距）］

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)圖（HE染色，200倍）

3 討 論

腸上皮細(xì)胞（IECs）的完整性缺失和腸屏障滲透性增高會導(dǎo)致UC發(fā)生，而緊密連接（TJs）在腸腔和黏膜間起到重要的防御作用［7］。Occludin是一種分子量65 kDa的跨膜蛋白，在與轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，既是結(jié)構(gòu)也是功能蛋白［8］。當(dāng)Occludin表達(dá)減少，非限制性轉(zhuǎn)運(yùn)通道異常開啟，使細(xì)菌抗原、毒素等大分子物質(zhì)異常通過并進(jìn)入IECs［9］，引起黏膜免疫的調(diào)節(jié)異常，加重了腸屏障的破壞和功能紊亂［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腸道的Occludin蛋白表達(dá)量明顯降低，這與目前的主觀認(rèn)識相一致。

該方法建立的UC大鼠模型可出現(xiàn)下利膿血、泄瀉、畏寒蜷縮及抱團(tuán)顫抖等表現(xiàn)，結(jié)合癥狀體征可辨證為寒熱錯(cuò)雜證。烏梅丸是寒熱錯(cuò)雜證的基礎(chǔ)方［11］，美沙拉秦是輕中度UC的常規(guī)用藥［11］，當(dāng)采用清腸溫中方治療并對比療效后發(fā)現(xiàn)，清腸溫中方能明顯減輕疾病程度、降低疾病相關(guān)各項(xiàng)評分、促進(jìn)黏膜修復(fù)和上調(diào)Occludin表達(dá)，其治療效果與美沙拉秦相當(dāng)，尤其是對結(jié)腸黏膜的修復(fù)，效果更是優(yōu)于烏梅丸。

《靈樞·百病始生》提到“兩虛相得，乃客其形”，扶正祛邪是中醫(yī)治病的重要原則。本文通信作者李軍祥教授認(rèn)為此病病位在腸，與脾胃關(guān)系密切。病性為本虛標(biāo)實(shí)、寒熱錯(cuò)雜；本虛為脾陽不足，標(biāo)實(shí)為濕熱內(nèi)蘊(yùn)或夾瘀血；病因病機(jī)為外感濕熱之邪，或飲食不節(jié)，脾胃受傷；或情志不暢，肝氣犯脾，日久導(dǎo)致脾胃虛弱，運(yùn)化失司，水濕內(nèi)停，濕郁化熱，濕熱內(nèi)蘊(yùn)，而濕熱與腸道氣血相搏結(jié)，氣血凝滯，化為膿血。因此，李教授謹(jǐn)守病機(jī)，創(chuàng)立了相應(yīng)治法的清腸溫中方。

方中以炮姜、炙甘草溫中健脾、培補(bǔ)后天陽氣；黃連、苦參、青黛苦寒清熱燥濕，同時(shí)配伍理氣活血藥，共奏溫中健脾、清熱燥濕、調(diào)氣理血之效。張冰［12］在總結(jié)謝晶日教授觀點(diǎn)后指出：脾胃虛弱為UC的發(fā)病之本，氣滯血瘀為標(biāo)實(shí)，因此在治療上當(dāng)以扶正為主，這與本文通信作者李教授提出的觀點(diǎn)相一致。此外，現(xiàn)代研究顯示黃連素及其總生物堿均具有顯著的抗?jié)冏饔茫?3］；青黛對于難治性UC有明顯的療效并能改善相關(guān)癥狀［14］；苦參總堿能夠抑制 NF-κB 的活化，減少炎性因子表達(dá)［15］；三七對改善黏液血便尤為顯著，能夠提高遠(yuǎn)端UC的臨床療效［16］；此外地榆也具有抗炎及調(diào)節(jié)免疫等作用［17］。

溫中健脾、清熱燥濕法正是從脾胃入手，著重培補(bǔ)后天之陽，以苦寒燥濕為輔，兼以調(diào)氣理血，才能起到治療UC的功效。后天之本得以鞏固，一身之正氣方可充沛，營氣充實(shí)、衛(wèi)氣活躍才能溫養(yǎng)腸黏膜淺表的分肉和腠理、抵御外邪，起到了與腸屏障同等重要的防御功能［18］。余秀婷發(fā)現(xiàn)黃連素能上調(diào)TJs以及抗凋亡蛋白表達(dá)，進(jìn)而修復(fù)腸屏障［19］；馬家寶指出三七總皂苷可以明顯促進(jìn)Occludin蛋白表達(dá)并修復(fù)TJs［20］。本研究也發(fā)現(xiàn)清腸溫中方可以明顯增加Occludin蛋白表達(dá)，而這可能就是溫中健脾、清熱燥濕法修復(fù)TJs、改善腸屏障，從而發(fā)揮治療UC的潛在機(jī)制。

本課題組還發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中清腸溫中方的不同劑量療效不同，其中，與臨床患者用量相同的中劑量在改善各項(xiàng)指標(biāo)時(shí)效果最突出，這可能分別與高、低劑量引起大鼠的毒副作用或過低刺激無法應(yīng)答有關(guān)，進(jìn)一步的具體機(jī)制我們將在后續(xù)開展更為詳細(xì)的拆方研究。此外，Occludin蛋白表達(dá)情況與UC嚴(yán)重程度間存在某種平行升降的關(guān)系，下一步我們將通過更深層次的分子生物學(xué)和信號通路，展開兩者相關(guān)性的具體研究，為溫中健脾、清熱燥濕法在UC中潛在的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用尋找科學(xué)依據(jù)。