張建影 李 雅 郭志華 易 瓊 任 欣 劉 梨

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208）

動脈粥樣硬化是一種由動脈壁脂質(zhì)潴留，血管內(nèi)皮損傷引起的慢性炎癥性疾病，是導(dǎo)致心腦血管疾病發(fā)生的重要因素［1-2］。動脈粥樣硬化具有經(jīng)典炎癥變性、滲出和增生的特點(diǎn)，炎癥反應(yīng)是動脈粥樣硬化致病的共同環(huán)節(jié)或通路，其可通過激活單核細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥因子，從而誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生遷移和增殖，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷和炎癥細(xì)胞激活，是動脈粥樣硬化形成的主要原因?？寡?、保護(hù)血管內(nèi)皮治療對防治動脈粥樣硬化具有重要作用［3-4］。心痛泰可有效治療動脈粥樣硬化，前期研究表明：其可通過降低動脈粥樣硬化家兔的核因子-κB（NF-κB）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血清脂蛋白相關(guān)磷脂酶 A2（Lp-PLA2）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、主動脈高敏C反應(yīng)蛋白 （hs-CRP）、血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體1（LOX-1）的表達(dá)，提高抗炎因子白細(xì)胞介素-10（IL-10）的表達(dá)，抑制動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)［5-6］。本文在前期研究基礎(chǔ)上，以動脈粥樣硬化兔為實驗對象，通過測定Toll樣受體4（TLR4）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、髓過氧化物酶 （MPO）、Ras基因家族成員A（RhoA）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表達(dá)，進(jìn)一步研究心痛泰能否通過Toll樣受體、MAPK以及Ras基因家族等信號通路調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)，為中藥新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

120 只雄性日本大耳白兔，清潔級，10~12周齡，體質(zhì)量（2.19±0.135）kg，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（湘）2009-0012。動物購進(jìn)后，單籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物及飼料

心痛泰由丹參、川芎、三七、郁金、木香、山楂、枳殼、葛根組成，中藥飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)本院藥劑科鑒定所有藥材均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。取2倍量處方藥材，溫水浸泡1 h，水量超出藥物5~6 cm，大火煮沸后轉(zhuǎn)小火煎30 min，趁熱過濾，藥渣按前法再煎煮兩次，將3次藥液混勻、過濾，減壓濃縮至每克藥粉相當(dāng)于15 g生藥。瑞舒伐他汀鈣片，規(guī)格：10 mg/片，購自阿斯利康制藥有限公司。高脂飼料由77.5%基礎(chǔ)飼料、15%蛋黃粉、5%豬油、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉組成，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心加工而成。

1.3 試劑及儀器

p-p38 抗體 （Bioss，Bs-0636R），MPO 抗體（Bioss，Bs-4943R），RhoA 抗體 （Bioss，Bs-1180R），TLR4 抗體（BOSTER，BA1717），eNOS 抗 體 （Abcam，Ab66127），GAPDH 抗體（CST，#5174），羊抗兔 HRP 標(biāo)記二抗（碧云天生物技術(shù)研究所，A0208），羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗（碧云天生物技術(shù)研究所，A0216）；Trizol（invitrogen 公司產(chǎn)品），DEPC處理水 （上?；鶢栴D生物科技有限公司），氯仿、異丙醇、無水乙醇（國藥集團(tuán)有限公司產(chǎn)品），SYBR Green PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司），RNaseⅠ（Fermentas公司），PCR 引物由上海捷瑞合成。電子天平秤（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司，TP-2200B），電泳儀（BIO-RAD 公司，mini protean 3 cell），電轉(zhuǎn)儀（大連競邁科技有限公司，PS-9），酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃酶標(biāo)儀，型號為MK3），吉爾森P型移液器（Pipetman），水浴鍋（萊卡公司），旋渦振蕩器（上海青浦瀘西儀器廠），手握式電動勻漿機(jī) （德國FLUKO公司，F(xiàn)6/10）， 低溫冷凍離心機(jī) （Sigma 公司，3K15），Real-time檢測儀（ABI公司，ABI-7300），超純水分離系統(tǒng)（美國LABCONCO 公司，90005-002）。

1.4 分組與造模

采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合免疫損傷建立兔動脈粥樣硬化模型［7-8］：將120只大耳白兔隨機(jī)分為空白組、模型組、心痛泰高劑量組、心痛泰中劑量組、心痛泰低劑量組、瑞舒伐他汀組（陽性組）各20只。除空白組外，其余組均在造模的第1天開始采用高脂飼料喂養(yǎng)，30 g/（kg·d），每日 2次；并于造模第 1天和第 7天耳緣靜脈注射10%牛血清白蛋白（250 mg/kg），同時卵清白蛋白皮下注射，2.5 mg/kg，每2日1次，共5次。

1.5 給藥方法

造模的同時予藥物灌胃干預(yù)治療，灌胃劑量根據(jù)人與兔的體表面積公式換算，心痛泰高、中、低劑量組給藥量分別為9.2、4.6、2.3 g/kg，瑞舒伐他汀組給藥量為0.55 mg/kg，空白組和模型組予同等體積生理鹽水灌胃。灌胃量每次10 mL/kg，連續(xù)8周。

1.6 標(biāo)本采集與檢測

實驗結(jié)束后，予25%烏拉坦4 mL/kg耳緣靜脈麻醉，空氣栓塞法處死。冰臺無菌操作迅速取主動脈弓下2.5~4.0 cm的胸主動脈段，縱行剖開，剪碎置于液氮中凍存，用于HE染色、Western blotting、RT-PCR檢測。

1.6.1 Western blotting 檢測 TLR4、p38 MAPK、MPO、RhoA、eNOS蛋白的表達(dá) 將取出的主動脈組織剪成碎片，按每20 mg組織加入150~250 μL裂解液的比例加入裂解液，勻漿器勻漿直至完全裂解，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。配膠后上樣，進(jìn)行電泳，采用48 mmol/L Tris、39 mmol/L glycine、0.04%SDS、20%甲醇配置電轉(zhuǎn)緩沖液進(jìn)行轉(zhuǎn)模，5%脫脂奶粉 （檢測磷酸化蛋白用BSA）室溫封閉1 h，分別加入適量稀釋后抗體RhoA（1∶100）、NF-κB（1∶1000）、eNOS（1∶400）、p38（1∶200）、TLR4（1∶150）、MPO（1∶100）、GAPDH（1∶1500），4 ℃孵育過夜。孵育一抗的膜用TBST洗滌5 min×2次，TBS洗滌 5 min×1次。隨后按照1∶1000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，與膜37℃孵育1 h。用TBST洗滌5 min×2次，TBS洗滌5 min×1次。加入適量增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）發(fā)光試劑，暗室內(nèi)曝顯影，圖像分析。

1.6.2 RT-PCR 檢測 TLR4、p38 MAPK、MPO、RhoA、eNOS mRNA的表達(dá) 取組織置于Trizol的勻漿管中，于勻漿機(jī)勻漿20 s，酚-氯仿法提取各組細(xì)胞總RNA，測定 RNA 的完整性；37 ℃，30 min；Hold， 加 1 μL 的EDTA；65℃，10 min條件下消除總RNA中的 DNA，37℃，60 min；85℃，5 min；4℃，5 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，-20℃保存；以cDNA以模板，與基因特異性引物，通過 PCR 擴(kuò)增 TLR4、p38 MAPK、MPO、RhoA、eNOS，內(nèi)參基因選定為GAPDH；采用儀器自帶軟件ABI Prism 7300 SDS Software測定分析，實驗重復(fù)3次。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗及組間方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布及方差齊性，采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布、方差分析，采用Kruska-Wallis H進(jìn)行統(tǒng)計處理；組間兩兩比較采用LSD法。檢驗水準(zhǔn)為0.05。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組兔主動脈組織病理學(xué)變化比較

見圖1?？瞻捉M兔主動脈組織未見粥樣斑塊，鏡下內(nèi)膜光滑而完整，內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)緊密，基本無內(nèi)膜增厚及斑塊形成。模型組兔主動脈動脈肉眼可見大量粥樣斑塊明顯形成，鏡下內(nèi)膜壁明顯增厚，形成較大斑塊且突出管腔，內(nèi)膜下大量泡沫細(xì)胞聚集及炎性細(xì)胞浸潤；中膜被破壞，彈性纖維、平滑肌細(xì)胞排列疏松紊亂，符合動脈粥樣硬化病理學(xué)改變，說明高脂飼料飼養(yǎng)聯(lián)合免疫損傷方法造模動脈粥樣硬化兔成功。陽性組肉眼可見極少量粥樣斑塊，鏡下內(nèi)膜稍增厚，內(nèi)膜下可見少量泡沫細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤；內(nèi)彈性膜未被破壞，中膜完整。心痛泰低劑量組肉眼可見較多粥樣斑塊，鏡下內(nèi)膜明顯增厚形成斑塊，可見泡沫細(xì)胞聚集及炎性細(xì)胞浸潤，內(nèi)膜破壞，與靠近內(nèi)膜的部分中膜相融合；中膜內(nèi)彈性纖維、平滑肌細(xì)胞排列較整齊。心痛泰中、高劑量組肉眼見少量粥樣斑塊，鏡下內(nèi)膜增厚較模型組明顯減低，內(nèi)膜下可見泡沫細(xì)胞聚集及炎性細(xì)胞浸潤；內(nèi)彈性膜未被破壞，中膜完整。

圖1 各組主動脈組織病理切片（HE染色，400倍）

2.2 各組TLR4蛋白、TLR4 mRNA表達(dá)比較

見表2，圖2。與空白組比較，模型組TLR4蛋白、TLR4 mRNA表達(dá)升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，心痛泰低劑量組TLR4蛋白、TLR4 mRNA表達(dá)均降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）；與模型組比較，心痛泰中劑量組TLR4蛋白表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），心痛泰中劑量組TLR4 mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）；陽性組、心痛泰高劑量組TLR4蛋白、TLR4 mRNA表達(dá)均降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；心痛泰高劑量組TLR4蛋白、TLR4 mRNA表達(dá)雖高于陽性組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組p38MAPK蛋白、p38 MAPK mRNA表達(dá)比較

見表3，圖3。與空白組比較，模型組p38 MAPK蛋白、p38 MAPKmRNA表達(dá)升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，心痛泰低劑量組p38 MAPK蛋白表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，心痛泰低劑量組p38 MAPK mRNA表達(dá)降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，陽性組、心痛泰高、中劑量組p38 MAPK蛋白、p38 MAPK mRNA表達(dá)均降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；心痛泰高劑量組p38 MAPK蛋白表達(dá)高于陽性組，p38 MAPK mRNA表達(dá)低于陽性組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組TLR4蛋白、TLR4 mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 各組TLR4蛋白、TLR4 mRNA表達(dá)比較（±s）

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同

組 別 n TLR4蛋白 TLR4 mRNA空白組 18 0.765±0.055 0.003±0.0003模型組 15 2.283±0.291* 0.017±0.002*陽性組 14 0.951±0.113△△ 0.006±0.001△△心痛泰低劑量組 16 2.158±0.123 0.014±0.001心痛泰中劑量組 15 1.632±0.212 0.010±0.001△心痛泰高劑量組 14 1.090±0.148△△ 0.007±0.001△△

圖2 各組TLR4的蛋白表達(dá)條帶

表3 各組p38 MAPK蛋白、p38 MAPK mRNA表達(dá)比較（±s）

表3 各組p38 MAPK蛋白、p38 MAPK mRNA表達(dá)比較（±s）

組 別 n p38 MAPK蛋白 p38 MAPK mRNA空白組 18 0.251±0.020 0.008±0.0012模型組 15 1.141±0.152* 0.071±0.005*陽性組 14 0.358±0.023△△ 0.020±0.004△△心痛泰低劑量組 16 0.837±0.099 0.048±0.006△△心痛泰中劑量組 15 0.608±0.038△△ 0.040±0.0033△△心痛泰高劑量組 14 0.370±0.028△△ 0.019±0.003△△

圖3 各組p38 MAPK蛋白表達(dá)條帶

2.4 各組MPO蛋白、MPO mRNA表達(dá)比較

見表4，圖4。與空白組比較，模型組MPO蛋白、MPO mRNA表達(dá)升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，心痛泰低劑量組MPO蛋白、MPO mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組、心痛泰高、中劑量組MPO蛋白、MPO mRNA表達(dá)均降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；心痛泰高劑量組MPO蛋白表達(dá)雖高于陽性組，心痛泰高劑量組與陽性組MPO mRNA表達(dá)相當(dāng)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組MPO蛋白、MPO mRNA表達(dá)比較（±s）

表4 各組MPO蛋白、MPO mRNA表達(dá)比較（±s）

組別 n MPO蛋白 MPO mRNA空白組 18 0.274±0.018 0.003±0.0005模型組 15 1.914±0.176* 0.024±0.003*陽性組 14 0.355±0.024△△ 0.011±0.003△△心痛泰低劑量組 16 0.706±0.067△ 0.017±0.002△心痛泰中劑量組 15 0.491±0.043△△ 0.014±0.0003△△心痛泰高劑量組 14 0.448±0.033△△ 0.011±0.002△△

圖4 各組MPO蛋白表達(dá)條帶

2.5 各組RhoA蛋白、RhoA mRNA表達(dá)水平比較

見表5，圖5。與空白組比較，模型組RhoA蛋白、RhoA mRNA表達(dá)升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）；與模型組比較，心痛泰低劑量組RhoA蛋白、RhoA mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組、心痛泰高、中劑量組RhoA蛋白、RhoA mRNA表達(dá)均降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；心痛泰高劑量組RhoA蛋白、RhoA mRNA表達(dá)雖高于陽性組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 各組RhoA蛋白、RhoA mRNA表達(dá)比較（±s）

表5 各組RhoA蛋白、RhoA mRNA表達(dá)比較（±s）

組 別 n RhoA蛋白 RhoA mRNA空白組 18 0.543±0.026 0.007±0.0006模型組 15 2.125±0.268* 0.025±0.001*陽性組 14 0.572±0.023△△ 0.011±0.0003△△心痛泰低劑量組 16 1.400±0.156△ 0.019±0.001△心痛泰中劑量組 15 0.748±0.039△△ 0.017±0.0006△△心痛泰高劑量組 14 0.645±0.028△△ 0.014±0.001△△

圖5 各組RhoA蛋白表達(dá)條帶

2.6 各組eNOS蛋白、eNOS mRNA表達(dá)的比較

見表6，圖6。與空白組比較，模型組eNOS蛋白、eNOS mRNA表達(dá)降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）；與模型組比較，陽性組、心痛泰高、中、低劑量組eNOS蛋白、eNOS mRNA表達(dá)均升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；心痛泰高劑量組eNOS蛋白表達(dá)低于陽性組、eNOS mRNA表達(dá)高于陽性組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表6 各組eNOS蛋白、eNOS mRNA表達(dá)比較（±s）

表6 各組eNOS蛋白、eNOS mRNA表達(dá)比較（±s）

組 別 n eNOS蛋白 eNOS mRNA空白組 18 0.568±0.033 0.019±0.0021模型組 15 0.175±0.013* 0.002±0.0001*陽性組 14 0.567±0.047△△ 0.013±0.001△△心痛泰低劑量組 16 0.336±0.022△△ 0.003±0.0003△△心痛泰中劑量組 15 0.376±0.024△△ 0.006±0.0005△△心痛泰高劑量組 14 0.489±0.058△△ 0.018±0.002△△

圖6 各組eNOS蛋白表達(dá)條帶

3 討 論

中醫(yī)無動脈粥樣硬化一說，但其多認(rèn)為，脈為心所主，是奇恒之腑，是氣血運(yùn)行的主要通道，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的血管在解剖形態(tài)上具有同一性，因此多將動脈粥樣硬化歸屬于“脈痹”的范疇。本病主要因外感六淫、情志內(nèi)傷、飲食勞倦等常導(dǎo)致臟腑氣機(jī)運(yùn)行障礙，氣機(jī)阻滯后常引起血液在脈道中運(yùn)行異常，脈絡(luò)瘀阻而發(fā)為本病，其病機(jī)多為“氣滯血瘀，阻滯經(jīng)絡(luò)”［9-10］。心痛泰以丹參活血祛瘀止痛，合有“血中氣藥”之稱的川芎共為君藥，三七、郁金、木香、山楂共為臣，助君藥調(diào)暢氣機(jī)祛瘀止痛，佐以葛根、枳殼，一升一降共調(diào)氣機(jī)。諸藥配伍，共奏活血化瘀、理氣止痛之功。

Toll樣受體是白細(xì)胞介素-1受體/Toll樣受體超家族的一部分，具有富含亮氨酸重復(fù)序列的細(xì)胞外N末端配體識別結(jié)構(gòu)域和具有Toll/白細(xì)胞介素-1受體（TIR）信號結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)羧基末端尾。TLR4是toll家族中重要的一員，其與動脈粥樣硬化的形成密切相關(guān)［11］。p38 MAPK是絲裂原活化蛋白激酶家族中最重要的抗炎成員之一，其可通過滲透性休克、氧化應(yīng)激等多種炎癥反應(yīng)促進(jìn)白細(xì)胞的聚集和活化，引起血管炎癥反應(yīng)［12］。MPO是炎癥及氧化應(yīng)激標(biāo)志物，可氧化脂蛋白，引起血管痙攣，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，促使斑塊糜爛、破裂，促進(jìn)動脈粥樣硬化。同時，MPO通過與結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)皮下基質(zhì)，浸潤血管組織，消耗一氧化氮，引起血管內(nèi)皮舒張功能障礙［13］。RhoA是小G蛋白Ras大家族Rho亞族的成員，是重要的細(xì)胞內(nèi)信號分子，RhoA被激活后可與Rho激酶結(jié)合，進(jìn)一步磷酸化下游底物，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的分泌、增殖等；有研究表明，RhoA蛋白與Rho激酶活化后可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)［14-15］。血管內(nèi)皮的損傷是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的重要原因，而eNOS可依賴氧化應(yīng)激影響內(nèi)皮功能和新生內(nèi)膜形成，在動脈粥樣硬化小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)eNOS解聚導(dǎo)致的超氧陰離子的生成作用顯著增加，加速小鼠的動脈粥樣硬化斑塊的形成［16-17］。

本研究結(jié)果顯示，心痛泰可降低TLR4、p38 MAPK、MPO、RhoA蛋白及其mRNA的表達(dá)水平，升高eNOS蛋白及mRNA的表達(dá)水平；且在心痛泰使用到高劑量時，其調(diào)控作用更加顯著。這可能闡釋心痛泰通過降低TLR4、p38 MAPK、MPO等炎癥因子，降低與血管內(nèi)皮功能相關(guān)的RhoA表達(dá)水平，提高eNOS的表達(dá)水平，從而起到減輕動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)，保護(hù)血管內(nèi)皮，來起到治療動脈粥樣硬化的作用，且其調(diào)控作用與其使用劑量呈正相關(guān)。