楊 斌 徐榮謙 楊冬妹 孫洮玉△

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

氣道平滑肌細(xì)胞肥大、過(guò)度增殖是咳嗽變異性哮喘（簡(jiǎn)稱CVA）氣道重塑的重要病理生理基礎(chǔ)［1］。誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡，增進(jìn)其自噬，有助于逆轉(zhuǎn)CVA氣道重塑，改善氣道高反應(yīng)性［2］。加味芎蝎散是徐榮謙教授的經(jīng)驗(yàn)方，由傳統(tǒng)古方芎蝎散加減而來(lái)，臨床運(yùn)用效果斐然，特別在解痙平喘上療效顯著［3-4］，提示該藥可能具有松弛支氣管平滑肌，減少氣道炎癥的作用［4］。前期研究發(fā)現(xiàn)，加味芎蝎散可以誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞凋亡來(lái)逆轉(zhuǎn)氣道重塑［5］。而自噬與凋亡之間存在著復(fù)雜的的內(nèi)在關(guān)系，它們可受共同的上游信號(hào)調(diào)控［6］。對(duì)于自噬機(jī)制是否參與CVA氣道重塑以及加味芎蝎散是否干預(yù)自噬蛋白的表達(dá)，筆者現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠40只，健康雌雄各半，體質(zhì)量（140±20）g，8周齡，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。SPF級(jí)動(dòng)物環(huán)境，自由攝食、飲水，并通過(guò)動(dòng)物研究委員會(huì)同意。

1.2 試藥與儀器

1）試藥：孟魯司特鈉片（杭州默沙東，4 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字J20070058），加味芎蝎散方（組成：川芎5 g，全蝎 3 g，蘆根 20 g，蓽茇 1 g，半夏 5 g，細(xì)辛 1 g，五味子10 g，白前10 g），東直門醫(yī)院制劑室提供顆粒劑，常溫保存。卵蛋白VOA （美國(guó)Sigma，批號(hào)：A5253-1009），氫氧化鋁凝膠（美國(guó) Sigma，批號(hào)：A8222-250 mL），Masson 三色試劑盒（北京 Solarbio），LC3（美國(guó) Abcam，貨號(hào) ab207612，批號(hào)：GR219675-1）、Beclin1 兔多克隆抗體（美國(guó) Abcam，貨號(hào) ab192890，批號(hào)：GR3174342-14）、二抗 PV6000 和 DAB（北京中杉金橋）。2）儀器：霧化器（WH-2000，廣東粵華），全自動(dòng)脫水機(jī)（TP1020，德國(guó) Leica），切片機(jī)（RM2235，德國(guó) Leica），電子顯微鏡（ASM510，德國(guó) Zeiss），病理圖像分析系統(tǒng)（Cmias，北航）。

1.3 造模與分組

40只SD大鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、模型組、孟魯司特鈉組、中藥組。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［7］及既往研究工作基礎(chǔ)建立CVA模型。采用OVA聯(lián)合Al（OH）3多次激發(fā)致敏法造模，除對(duì)照組外，其余各組第1日肌注2%OVA 1 mL，腹腔注射 Al（OH）31 mL［內(nèi)含 Al（OH）3200 mg］，從第14日起，用超聲波霧化器1%OVA溶液攻擊，每天1次，持續(xù)1周。以大鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹肌收縮、咳嗽等表現(xiàn)以及血中嗜酸粒細(xì)胞百分比顯著高于空白對(duì)照組確定模型成功?？瞻讓?duì)照組與模型組以等量生理鹽水灌胃，中藥組用生理鹽水溶解中藥顆粒劑配成藥液（相當(dāng)于生藥 3.0 g/mL），以中藥組 50 g/（kg·d），孟魯司特鈉組 1 mg/100 （g·d）灌胃給藥，每日 1 次，共 30 d。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.4.1 各組肺組織病理學(xué)形態(tài)學(xué)觀察 統(tǒng)一取SD大鼠左肺，10%中性甲醛，切開固定，脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察各組肺組織病理學(xué)改變并行嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。肺泡灌洗液（BALF）離心、沉淀、重懸、涂片，行瑞氏染色并行嗜酸細(xì)胞計(jì)數(shù)，光學(xué)顯微鏡下，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，求出嗜酸細(xì)胞EOS占比。

1.4.2 平滑肌增生與膠原沉積觀察 Masson三色特染試劑盒，平滑肌組織染為紅色，膠原纖維為藍(lán)色。選擇完整氣道，分別測(cè)定支氣管基底膜周徑（Pbm）、管壁厚度（Wd）、總管壁面積（WAt）、平滑肌層面積（WAm）、平滑肌層厚度 （Md）。結(jié)果統(tǒng)一用各組織基底膜周徑（Pbm）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化 （即分別用 Wd/pbm、WAt/pbm、WAm/pbm、Md/pbm表示氣道重構(gòu)程度）。

1.4.3 自噬蛋白Beclin1和LC3檢測(cè) 1）免疫組化：石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）高壓煮沸3 min進(jìn)行抗原修復(fù)，3%H2O2阻斷10 min。一抗4℃過(guò)夜，37℃復(fù)溫30 min，二抗孵育20 min，DAB鏡下顯色，水洗，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察組織著色情況。采用Image-pro Plus6.0圖像分析軟件測(cè)定相關(guān)蛋白含量，以平均光密度表示。2）免疫印跡：取新鮮右肺組織，將支氣管平滑肌組織剝離出，稱取100 mg，放入含蛋白抽提液的勻漿器內(nèi)，提取總蛋白，測(cè)定蛋白質(zhì)含量，取50 μg蛋白質(zhì)，聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)封閉、一抗4℃過(guò)夜、二抗孵育、洗滌，加ECL顯色液，用Quantity one 4.1.1測(cè)定，結(jié)果與該樣品對(duì)應(yīng)的內(nèi)參GAPDH做對(duì)照，比值表示目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間差別采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織病理學(xué)改變

見圖1。光鏡下HE染色示：空白對(duì)照組未見異常，模型組支氣管黏膜4層均有不同程度的損傷，黏膜上皮層纖毛柱狀上皮細(xì)胞變性、脫落，黏膜下層輕度水腫，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肌層肥厚，平滑肌細(xì)胞增生、肥大，外膜層膠原纖維增生，基底膜不完整。孟魯司特鈉組和中藥組均有明顯的減輕作用。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)改變（HE染色，200倍）

2.2 各組大鼠肺組織氣道壁平滑肌增生和膠原沉積

見表1。光鏡下Masson染色及圖像分析示：與空白組相比，模型組膠原纖維沉積、Wd、Md以及平滑肌細(xì)胞數(shù)較其他各組有明顯的增加，而中藥組有明顯減輕作用。而中藥組與孟魯司特鈉組有明顯減輕作用。兩者相比無(wú)顯著差異。

表 1 各組大鼠 Md、WAm、Wd、膠原沉積比較（分，±s）

表 1 各組大鼠 Md、WAm、Wd、膠原沉積比較（分，±s）

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同

組 別 n Md（Pbm） WAm（μm2） Wd（Pbm） 膠原沉積（%）空白對(duì)照組 10模型組 10孟魯司特鈉組 10 2.24±0.36 14.45±0.85 9.80±1.35 4.84±0.96 7.84±1.02** 32.56±3.36** 21.45±1.66** 11.32±1.88 4.15±0.62△△ 24.57±2.15△ 14.58±1.83△△ 9.24±1.06△中藥組 104.10±0.54△△ 22.03±1.87△△ 15.22±1.76△△ 9.58±1.30△

2.3 各組大鼠肺組織Beclin1和LC3免疫組化結(jié)果比較

見表2。Beclin1和LC3在氣道黏膜上皮、氣道平滑肌、血管平滑肌及個(gè)別炎細(xì)胞中胞漿上呈陽(yáng)性表達(dá)，本次實(shí)驗(yàn)僅觀察統(tǒng)計(jì)氣道平滑肌組織染色。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)Beclin1和LC3在空白對(duì)照組中表達(dá)較高，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，特別在氣道平滑肌組織中，表達(dá)尤為顯著。而在模型組中，表達(dá)低，呈弱陽(yáng)性表達(dá)，主要分布在氣道黏膜上皮上，在氣道平滑肌細(xì)胞中呈微弱著色。與模型組相比，孟魯司特鈉組和中藥組表達(dá)明顯增強(qiáng)。

表2 各組大鼠氣道黏膜自噬蛋白Beclin1和LC3表達(dá)比較（IOD，±s）

表2 各組大鼠氣道黏膜自噬蛋白Beclin1和LC3表達(dá)比較（IOD，±s）

組 別 n Beclin1 LC3空白對(duì)照組 10模型組 10孟魯司特鈉組 10 11.95±1.89 12.56±1.38 6.58±0.88** 6.89±1.03**9.23±0.98△ 9.56±0.88△△中藥組 109.55±0.68△ 10.05±1.18△△

2.4 各組大鼠肺組織Beclin1和LC3免疫印跡結(jié)果

見表3，圖2。Beclin1和LC3在對(duì)照組表達(dá)較高，在模型組顯著降低，而孟魯司特鈉組和中藥組表達(dá)增強(qiáng)。

表3 各組大鼠氣道黏膜Beclin1和LC3表達(dá)比較（目標(biāo)蛋白/GAPDH，±s）

表3 各組大鼠氣道黏膜Beclin1和LC3表達(dá)比較（目標(biāo)蛋白/GAPDH，±s）

組 別 n Beclin1 LC3空白對(duì)照組 10模型組 10孟魯司特鈉組 10 0.87±0.08 0.81±0.08 0.56±0.07** 0.53±0.07**0.73±0.08△ 0.76±0.09△△中藥組 100.79±0.08△△ 0.75±0.07△△

圖2 各組大鼠肺組織Beclin1和LC3免疫印跡結(jié)果

3 討 論

氣道重塑是CVA的重要病理生理表現(xiàn)，包括上皮完整性缺失，杯狀細(xì)胞增生，基底膜增厚，平滑肌增生、肥大等。重塑通常是不可逆的，最終會(huì)導(dǎo)致氣道狹窄、氣流受限及氣道高反應(yīng)性等病理特征［8］。固有觀念認(rèn)為，氣道重塑是長(zhǎng)期炎癥未能得到有效控制的結(jié)果，但研究表明，哮喘初期已經(jīng)有明顯的氣道重塑，且氣道重塑可以發(fā)生在氣道炎癥之前，氣道炎癥被藥物完全控制后還能持續(xù)存在并繼續(xù)發(fā)展［9］，因此說(shuō)明，炎癥因素可能不是氣道重塑的最主要或者唯一機(jī)制。氣道平滑肌細(xì)胞（ASMCs）是氣道壁的主要結(jié)構(gòu)細(xì)胞，其功能包括增殖、肥大、表型轉(zhuǎn)化以及炎癥介質(zhì)分泌等，對(duì)于氣道重塑的發(fā)生發(fā)展具有重要作用［10-11］。在以往的研究中，我們證實(shí)了氣道平滑肌細(xì)胞凋亡減少是CVA氣道重塑的可能機(jī)制之一，而加味芎蝎散有增加氣道平滑肌凋亡的作用［5］。自噬和凋亡通路間存在交互作用，有研究指出，自噬和凋亡有共同的上游信號(hào)調(diào)控，Beclin-1和Bcl-2是其中的關(guān)鍵分子［12-14］。本次HE染色和Masson染色實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，CVA大鼠平滑肌組織增生、肥大，膠原沉積，纖維化程度增強(qiáng)。免疫組化和WB實(shí)驗(yàn)都證實(shí)，CVA大鼠自噬蛋白Beclin1和LC3明顯降低，而加味芎蝎散組有明顯的改善作用，和孟魯司特鈉組療效無(wú)明顯差異。我們推測(cè)加味芎蝎散可以通過(guò)提高平滑肌組織中自噬蛋白Beclin1和LC3的表達(dá)，增加平滑肌細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞的增生并同時(shí)減緩氣道重塑纖維化過(guò)程。

在自噬與重塑纖維化機(jī)制的聯(lián)合研究中，多種不同臟器的纖維化與自噬有共促進(jìn)作用，比如在肝細(xì)胞，自噬可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞纖維化，通常的解釋為：重塑纖維化的過(guò)程中，需要大量的基質(zhì)蛋白的合成，合成則需要大量的能量，而細(xì)胞自噬增加可以提供這些能量［15］。但肺組織不同于其他臟器，肺組織中自噬功能的減低可能增強(qiáng)了氣道平滑肌細(xì)胞的增生以及膠原纖維化，從而促進(jìn)了氣道重塑。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除了自噬基因ATG4B的大鼠模型，博來(lái)霉素可以誘導(dǎo)肺纖維化的發(fā)生［16］。

芎蝎散是宋代陳文中《小兒病源方論》的家傳累世之名方。研究發(fā)現(xiàn)本方用于CAV患者療效佳［17］。徐榮謙教授吸收中醫(yī)兒科先賢使用芎蝎散之寶貴經(jīng)驗(yàn)，在芎蝎散的基礎(chǔ)上加細(xì)辛、蓽茇、半夏、白前、五味子、蘆根，形成加味芎蝎散。徐榮謙教授認(rèn)為，CVA患兒臨床特征多為長(zhǎng)期慢性咳嗽，符合血瘀的致病機(jī)理。故用川芎為君藥，旨在活血行氣，祛風(fēng)止痛?，F(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為，川芎嗪能抑制氣道壁TGF-β的表達(dá)，有利于減輕氣道重建［18］；全蝎搜風(fēng)通絡(luò)，以散肺風(fēng)為臣藥；細(xì)辛、蓽茇、半夏溫肺化痰；白前溫肺降氣祛痰；五味子斂肺止咳；蘆根清肺止咳，為佐使藥。全方共奏活血祛風(fēng)，化痰止咳之功。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CVA大鼠氣道平滑肌自噬蛋白降低，有可能是促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增生、肥大的機(jī)制之一，而加味芎蝎散可能通過(guò)提高自噬蛋白的表達(dá)，抑制氣道平滑肌增生，抑制氣道重塑的發(fā)生發(fā)展，改善病情。本研究將對(duì)我們進(jìn)一步明確加味芎蝎散治療CVA的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。