陳麗娜，溫宇旗，韓國慶，王耀新，王繼明，杜 芳，逯振宇，蘇秀蘭

（1.內(nèi)蒙古蒙肽生物工程有限公司研究院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學臨床醫(yī)學研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050）

肽是一類分子量介于50～10 000 Da，結構介于氨基酸和蛋白質之間的分子聚合物[1]，經(jīng)試驗證實肽類具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌、降血壓、降膽固醇、神經(jīng)調節(jié)、免疫調節(jié)等生物活性，故稱之為生物活性肽。人們通常根據(jù)肽的功能定義活性肽，如抗菌肽、免疫肽、降壓肽等，也有根據(jù)肽的分子量大小定義肽，分子量＜1 000 Da稱為小肽或寡肽，分子量在1 000～5 000 Da的叫多肽，分子量在5 000～10 000 Da的稱為大肽，分子量＞10 000 Da的一般為蛋白質。生物活性肽要比母體蛋白質具有更大的活性，肽易于消化，比蛋白質更具生物可利用性，能夠調節(jié)機體的生命活動，具有特殊的生理功能。

研究表明，肽影響著生物體內(nèi)許多重要的生理功能，目前已知的100多種內(nèi)源性生物活性肽參與人體多種生理功能，包括生命活動中的細胞生長、細胞代謝、細胞分化、激素遞質調節(jié)、腫瘤病變改善、免疫調節(jié)、新陳代謝及內(nèi)分泌調節(jié)等生理活動。目前發(fā)現(xiàn)并經(jīng)試驗證實的功效有[2-4]：①生物活性肽具有抗氧化、延緩衰老的作用。其原理是捕捉金屬離子或促進過氧化物的降解，清除細胞中多余的活性氧，達到抑制脂質過氧化的功效。目前，國內(nèi)外對肌肽和谷胱甘肽的抗氧化作用機理研究較為明確，其可以作為天然抗氧化物，具有無毒高效等特點。②1979年Christine Z等人首次報道生物活性肽具有神經(jīng)調節(jié)作用，神經(jīng)活性肽包括類鴉片、內(nèi)啡肽、腦啡肽，以及其他神經(jīng)活性肽，與體內(nèi)的α，β，γ-受體相互作用，可起到鎮(zhèn)痛、調節(jié)呼吸和體溫等功能。③陳彤等人[5]用體外抑菌試驗證明了生物活性肽的抗菌作用，抗菌肽是生物體在抵御病原微生物的過程中產(chǎn)生的具有抗微生物和惡性細胞功能的小肽，抗菌肽具有較強的抗菌活性，尤其是對某些耐藥性病原菌具有很強的殺傷力，抗菌肽的抗菌機制是非免疫球蛋白型抵御入侵的低分子量蛋白質，通過產(chǎn)酸或是抑制細菌細胞壁合成達到抗菌作用，抗菌肽還可以用于抗病毒、真菌、原蟲等。④生物活性肽還具有抗癌[6]、抗血栓、抗高血壓、激素作用、免疫調節(jié)、感官風味改善、營養(yǎng)保健等功效[7-8]。

1 生物活性肽的制備方法

生物活性肽由于其顯著的生物功效，在醫(yī)藥健康領域具有廣闊的應用前景，有的在實驗室獲得了巨大成功，有的已經(jīng)開發(fā)成藥品用于臨床，還有的在不斷探索和改進的過程中。制備高活性、高得率、工藝簡便的生物活性肽是肽研究的熱門方向。近五六十年來，科學家研究開發(fā)的生物活性肽制備方法歸結為3類：提取法、合成法和降解法。

1.1 提取法

提取法又分為化學提取法和物理提取法。

1.1.1 化學提取法

化學提取法可用于食品工業(yè)的強酸或強堿降解食物大分子蛋白質，待蛋白質中的肽鍵斷裂，終止反應，然后再對產(chǎn)物進行分離純化。有時也會用到一些有機溶劑進行提取，常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇和正丁醇等。

該方法生產(chǎn)成本低廉，但因為酸堿試劑可對蛋白質造成嚴重損害，破壞多肽結構，反應程度不容易控制，故無法明確其功能，而且該方法副產(chǎn)物較多、提取步驟繁瑣、提取率低，實驗室小試還可以實現(xiàn)，無法實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。以上多種因素限制了該方法的廣泛使用。

1.1.2 物理提取法

物理提取法是近年來提出的新概念[9]，該處理方法不加入任何化學試劑，主要是一種依靠超高壓連續(xù)細胞流儀器制備多肽的方法，該儀器可以使大腸桿菌細胞破碎程度達到90%以上，所以通過該機器的作用，動植物組織已經(jīng)全部裂解，且細胞壁、細胞膜已經(jīng)破裂，胞內(nèi)活性物質釋放，經(jīng)過連續(xù)細胞流裂解成小分子多肽。該方法最大程度地保證了多肽的生物活性，但是對設備要求高、單次處理量小、多肽得率低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

1.2 合成法

合成法包括化學合成法和基因重組法。

1.2.1化學合成法——固相合成

1963年，美國人梅里菲爾德首次發(fā)明了固相多肽合成法（SPPS技術）。多肽合成首先要確定出目標肽段中氨基酸的組成及排列順序，固相多肽合成一般是從C端（羧基端）向N端（氨基端） 重復添加氨基酸的過程[10]。合成法具有下述缺點：①副反應多，不易控制；②產(chǎn)生的肽活性低，多樣性差；③固相載體上中間體雜肽無法分離；④鏈接試劑的毒性殘留影響多肽的質量；⑤合成的多肽必須是結構和順序明確的肽，只能合成已知的，對未知有活性的肽無法合成，所以這大大縮小了多肽的范圍。

1.2.2基因重組法

基因重組技術簡言之就是將具有功能的目標多肽基因整合到宿主菌中進行克隆表達[11]，通過該方法得到的多肽產(chǎn)量和純度有很大的提高，是目前大量獲得某特定生物活性肽的有效途徑之一。該方法在生物醫(yī)藥領域應用廣闊。然而，基因重組技術只能合成大分子肽類和蛋白質，對人類主要需求的具有營養(yǎng)價值的小肽，方法不適用，而且與合成法一樣，目的片段結構不明確的多肽無法合成。另外，近年來歐美等國消費者普遍反對經(jīng)過基因生物工程食品、保健食品等。

1.3 降解法

降解法是將大分子量的蛋白質分解為分子量較小結構（較蛋白質簡單的肽），包括酶解法和發(fā)酵法。

1.3.1 酶解法

酶解法就是蛋白質類物質在蛋白酶的催化作用生成氨基酸和多肽的過程[12]，酶法多肽是當下制備多肽的一個熱門技術，是目前制備生物活性肽的主流方法。酶解法制備生物活性肽模擬人體降解蛋白質模式進行體外降解，降解產(chǎn)生的小肽與氨基酸吸收部位不同，不會與體內(nèi)氨基酸的吸收產(chǎn)生競爭。目前常用的工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶有胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、膠原蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風味蛋白酶和復配酶等。

酶解法的優(yōu)點包括：①制備的生物活性肽性能比較穩(wěn)定，在酸性條件和較高溫度時穩(wěn)定性良好；②相對于化學提取法，酶解法可利用的蛋白質資源多、酶解工藝操作簡單、提取周期快、酶解程度容易控制；③酶解法采用特定的蛋白酶，有目的地剪切肽段，以獲得所需功能活性的生物多肽[13]，同時多肽產(chǎn)量相對化學提取法也有很大的提升。在酶解法制備生物活性多肽的過程中，該方法最主要的是控制蛋白酶的添加量、溫度和體系的酸堿度，將蛋白物質水解成生物多肽混合物后，再進一步進行生物活性多肽的分離。

酶法法的缺點主要是：酶解法制備生物活性肽的過程均會產(chǎn)生苦味肽，蛋白質在酶解過程中會產(chǎn)生一些疏水性氨基酸，這些疏水性氨基酸和舌尖上的苦味受體結合便會產(chǎn)生苦味。酶解蛋白苦味的普遍存在性，使生物活性肽的應用受到很大的影響。一些研究者通過活性炭或硅藻土作為吸附劑分離苦味肽，也嘗試用外切酶切除苦味肽，或者采用醇提法，利用環(huán)糊精或多磷酸鹽等對低分子苦味肽進行絡合處理等方式進行脫苦，現(xiàn)在不少學者正在采用復合酶水解的方式，用3種或2種以上的酶酶解同一底物，或是引入風味蛋白酶試圖改變酶解產(chǎn)物的口感[14]。

復合酶酶解案例見表1。

表1 復合酶酶解案例

復合酶酶解效果好，得到的多肽活性高，且具有多樣性，但是該法只能適應1～2種蛋白質的催化降解，不能適應多種動植物蛋白的降解，需要根據(jù)不同的動植物蛋白質結構配制不同的復合酶，使用具有局限性。不論是單一酶酶解后再進行脫苦處理，還是復合酶酶解均存在著多肽產(chǎn)量較低、工藝復雜、成本較高等問題。

1.3.2 發(fā)酵法

發(fā)酵法，是在以上方法研究成熟的基礎上提出的一種新的制備生物活性肽方法，成為近年來研究肽制備工藝的熱點。該方法是通過菌種在生長代謝過程中產(chǎn)生的蛋白酶水解底物蛋白，底物蛋白不僅受到蛋白酶的水解作用，同時還受到發(fā)酵菌種的侵蝕作用，均會在一定程度上分解產(chǎn)生分解產(chǎn)物。底物蛋白既為細菌的生長繁殖提供營養(yǎng)物質，也是細菌分解的目標產(chǎn)物，構建了一個微生態(tài)反應圈，通過微生物發(fā)酵過程產(chǎn)生的蛋白酶（復合）降解蛋白質，可達到較高的水解度，從而相對降低酶法生產(chǎn)低聚肽的成本，并且可以利用微生物中的肽酶除去苦味肽，用于普通食品和功能性食品生產(chǎn)領域。發(fā)酵法制備生物活性肽有很多優(yōu)點[18]，蛋白酶來源廣、繁殖快、產(chǎn)量高、成本低，且得到的生物活性肽分子量較小，具備更優(yōu)良的生物活性、發(fā)酵工藝簡單、生產(chǎn)成本低、更易于產(chǎn)業(yè)化等，故應用前景廣闊。

發(fā)酵法的優(yōu)點有：①活性微生物菌體直接參與蛋白降解的生化代謝，底物蛋白既為微生物生長代謝提供能量，又是微生物代謝產(chǎn)物酶的作用底物，這樣的結構體系可減少廢物排放，使資源得到充分利用；②活性微生物菌體的生化代謝產(chǎn)物可以修飾某些功能基團[19]；③活性微生物菌體本身經(jīng)過代謝可以合成、分泌小肽物質；④微生物發(fā)酵法不同于酶法，酶法是簡單地切割固定的肽鍵，而發(fā)酵法通過微生物代謝產(chǎn)生的復合酶系，可以酶解釋放出高濃度特定的活性肽，酶解效率高；⑤微生物的代謝發(fā)酵可以合成多種復雜的初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物，但酶法不能[20]；⑥發(fā)酵過程中有大量的菌體細胞生長繁殖，微生物菌體的細胞壁主要成分是乙酰葡萄糖胺和乙酰胞壁酸，是細菌的一種特殊物質，在其他任何生物體內(nèi)均不存在，所以微生物菌體除具有營養(yǎng)作用外，還對生物體的免疫功能具有刺激作用[21]；⑦與酶法相比，微生物發(fā)酵法制備得到的生物活性肽水解度可提高10%～20%[22]；⑧發(fā)酵制備活性多肽的過程中，底物不僅受到蛋白酶的酶解作用，同時還受到菌的侵蝕作用，發(fā)酵產(chǎn)物比發(fā)酵原料的蛋白質增加4.53倍，比氨基酸增加1.43倍，而且通過發(fā)酵可以很好地平衡產(chǎn)物的氨基酸比例。

但微生物發(fā)酵法也有一些缺點：很多的產(chǎn)酶菌有毒或對人體有害，目前已經(jīng)證明無毒、可以用于食品開發(fā)的菌種并不多，安全問題、作用機理成為阻礙微生物發(fā)酵法制備活性肽的最大障礙。一些特殊功能的肽不是簡單的單一細菌代謝產(chǎn)物酶就可以降解的，而是需要根據(jù)生物活性肽的結構選擇符合要求的復合酶，微生物發(fā)酵產(chǎn)生復合酶體系酵解產(chǎn)生活性肽的機理尚未完全闡明，若可以闡明其中的作用機理，發(fā)酵法將比復合酶解法效率更高。

2 發(fā)酵法制備生物活性肽的應用實例分析

發(fā)酵技術廣泛應用于醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)、環(huán)保等諸多領域。通過發(fā)酵法制備活性肽應用于生物制品、食品制造業(yè)等，發(fā)酵底物通常為動物制品，如動物臟器、骨頭、深海魚肉及各種動物蛋白等，植物作為發(fā)酵底物有豆粕、豆、植物籽、各種糧食作物等，發(fā)酵制備活性肽常用菌種有霉菌，如黑曲霉、米曲霉菌等；細菌，如主要用來產(chǎn)生中性蛋白酶和堿性蛋白酶的枯草芽孢桿菌[23]，以及主要用來產(chǎn)生酸性蛋白酶的乳酸菌、嗜熱乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌等；產(chǎn)朊假絲酵母；黏質沙雷氏菌，主要產(chǎn)生一種具有消炎作用的金屬酶SMP；多黏芽孢桿菌，主要產(chǎn)生一種能夠特異性地降解纖連蛋白和IV型膠原蛋的中性蛋白酶；有去除腥味功效的酵母菌[24]。發(fā)酵法制備生物活性肽應用領域廣闊，底物來源豐富多樣，而且均為食源性蛋白質，安全有保障、營養(yǎng)豐富，發(fā)酵菌種種類繁多、功能各異，可以通過發(fā)酵制備出具有多種生理功能和多種來源的生物活性肽。

2.1 發(fā)酵制備牛乳蛋白多肽

牛乳含有豐富的蛋白質和多種氨基酸，是一種優(yōu)質的動物蛋白源。最近研究發(fā)現(xiàn)[25]，牛乳含有的天然蛋白肽中有些具有活性，如表皮生長因子（EGF）、轉化生長因子（TGF）等，在人體健康中起著重要作用。研究證明，乳源活性肽食用安全，利用瑞士乳桿菌對牛乳蛋白進行發(fā)酵，產(chǎn)生具有提高機體免疫力的以酪蛋白肽為主要物質的小分子多肽混合物。國外市場已有較多的乳源肽成熟產(chǎn)品，我國在1990年開始在該領域進行研究，研制出具有提高人體鈣、鐵、鋅等二價礦物質的攝入量和利用率的酪蛋白磷酸肽。

2.2 發(fā)酵制備豆類肽

發(fā)酵豆制品通常包括納豆、大醬、黃豆餅、醬油、腐乳、豆豉和豆瓣醬等[26]，通過發(fā)酵使大豆蛋白分解，產(chǎn)生大量氨基酸和風味酶，均衡營養(yǎng)比例，調整食品風味，生物利用率上升，促進人體吸收。在發(fā)酵過程中，結構復雜、分子量較大的大豆蛋白在微生物分泌的蛋白酶作用下可以水解釋放出多種氨基酸序列不同的生物活性肽，而且在自身蛋白酶催化下還可以合成新的多肽序列。發(fā)酵豆制品產(chǎn)生的生物活性肽可以與細胞受體相互作用，發(fā)揮多種的生物學功能，如抗氧化、降血糖、抗菌、抗癌、降血壓等[27-29]。

2.3 發(fā)酵制備各種餅粕多肽

花生、芝麻、大豆、棉籽、蓖麻、亞麻籽、菜籽、葵花籽等餅粕是經(jīng)榨油后的碎片狀或粉狀副產(chǎn)物，其中蛋白含量占干質量的30%～50%。餅粕蛋白中氨基酸齊全，必需氨基酸含量適中，是一種優(yōu)質的蛋白資源。經(jīng)驗證[30]，在最優(yōu)發(fā)酵條件下核桃活性肽得率可達35.68%，該活性肽在體外具有抗氧化活性，可清除DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子。目前文獻[31-32]報道的有發(fā)酵棉籽、油茶、菜籽這3種餅粕，發(fā)酵產(chǎn)物用作動物飼料，可以降低飼料成本，且營養(yǎng)價值顯著提高。

2.4 發(fā)酵動物血液制品制備活性肽

研究表明[33]，血多肽有降血壓和11.36%，必需氨基酸的總量提高了16.43%，花生粕的品質得到了明顯提高。增強免疫力的生物活性，而且血紅素肽是一種優(yōu)良的鐵補充劑。在歐洲等發(fā)達國家，動物血液的利用率已達50%以上，主要開發(fā)肽類試劑、肽類藥物，以及功能食品和食品添加劑，如奧地利愛維治小牛血去蛋白提取物就是臨床上應用非常廣泛的血液肽制品。湖南農(nóng)業(yè)大學方俊等人通過篩選高產(chǎn)酶菌株發(fā)酵制得豬血多肽，并對其清除活性氧能力、降血脂活性進行了相關研究，采用3株枯草芽孢桿菌經(jīng)過馴化后，在適宜的條件下，發(fā)酵豬血粉蛋白，最終經(jīng)分離得到具有活性的豬血多肽。與底物豬血粉蛋白相比，豬血多肽分子量大小、氨基酸種類及組成發(fā)生了變化。小分子豬血肽具有溶解性好、黏度低、抗凝膠形成和體內(nèi)消化快、可直接吸收等特點。

2.5 發(fā)酵動物臟器制備活性肽

經(jīng)查閱文獻可知，目前用于發(fā)酵研究的動物臟器有已經(jīng)廣泛用于臨床的脾多肽，也有掀起美容和保健熱潮的羊胎盤、鹿胎盤，還有以肝臟為原料進行多肽研究的，通過文獻檢索找到一篇名為“一種肝蛋白多肽的結腸靶向制劑及其制備方法”的專利，但是關于利用動物臟器制備生物活性肽的報道還是很少。侯銀臣等人[34]利用枯草芽孢桿菌對羊胎盤進行發(fā)酵，制備生物活性肽，研究了發(fā)酵過程中蛋白酶活性，發(fā)酵產(chǎn)物的平均肽鏈長度及分子量大小，同時對產(chǎn)物的抗氧化和免疫活性進行了研究，實現(xiàn)了可控制發(fā)酵羊胎盤制備免疫活性肽的技術，試驗證明羊胎盤活性肽還具有抗氧化作用。脾多肽在臨床上應用廣泛且療效顯著，藥用脾多肽的制備方法是直接提取法，目前還沒有報道通過發(fā)酵法制備脾多肽的方法，未來發(fā)酵法制備脾多肽也是一個獲得活性小分子多肽的不錯選擇。鮮有報道利用動物肝臟制備多肽的，目前通過文獻檢索找到一篇名為“一種肝蛋白多肽的結腸靶向制劑及其制備方法”，肝臟多肽的研究目前幾乎是空白，更沒有通過發(fā)酵法制備肝臟多肽的研究報道，對于做動物臟器多肽的企業(yè)或研究單位這是一個有效的切入點。

2.6 發(fā)酵制備動物骨肽

利用動物骨骼發(fā)酵制備動物骨肽的應用較為廣泛，主要有鹿骨、驢骨、各種深海魚骨、牛骨、牦牛骨、羊骨、畜禽軟骨等，常被做成骨泥或骨粉，用酶解法降解制備生物活性肽或回收蛋白質。目前，有關于發(fā)酵法制備骨多肽的報道甚少，發(fā)現(xiàn)2篇發(fā)酵制備牛骨多肽的文章，在牛骨的功能性開發(fā)利用方面，多以牛骨的蛋白質利用和鈣的轉化為主。唐勇等人[35]利用腸道中的有益菌——乳酸菌對超微骨粉進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)骨粉被研磨后顆粒的大小與發(fā)酵后牛骨粉產(chǎn)生的游離鈣離子量和游離氨基酸量存在相關性，在最佳工藝下，骨粉中蛋白質的最大水解率為63%，骨粉中結合鈣的最大游離轉化率為37%。郭耀華，劉麗莉等人[36-37]利用蠟樣芽孢桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵牛骨粉，制備牛骨血管緊張素轉換酶抑制肽，而且通過發(fā)酵可以使碳酸鈣活化為游離的鈣離子，口服易于人體鈣的吸收。通過發(fā)酵使骨骼中的多種氨基酸含量達到均衡，且釋放出大量具有生物功能的活性多肽。付文雯[38]研究了牛骨膠原多肽螯合鈣的制備和其結構的表面特征，骨中含有骨肽，骨肽中具有多肽、骨代謝調節(jié)因子：軟骨源性生長因子，轉化生長因子，骨生長因子，骨源性生長因子，成纖維細胞生長因子，γ-干擾素，白細胞介素-6等。對調節(jié)骨代謝、刺激成骨細胞再生、促進新骨形成均有效果，同時對防治骨質疏松具有一定的療效。利用微生物的作用降解骨粉中的蛋白質[39]，能夠使部分鈣從結合態(tài)游離出來，變成游離鈣。該法具有酶解、酸堿水解、基因工程等方法的共同作用，因此微生物發(fā)酵法是一種新的有效制備生物活性肽方法。

3 結語

生物活性肽由于其多種多樣的生物功能，被許多研究者廣泛研究，從發(fā)現(xiàn)至今，研究者不斷挖掘出生物活性肽的多種生理功能，不斷創(chuàng)新出多種制備方法，對生物活性肽的理化性質也有了深入的了解，生物活性肽的組成、排列順序和肽鏈長度不同，導致了不同的溶解度、脂質結合型、發(fā)泡性、乳化性，同時也在不斷發(fā)掘新型制備活性肽的原料從植物性原料，到動物性原料，再到幾年前研究火熱的以海洋生物為原料制備活性肽，現(xiàn)階段綜合考慮產(chǎn)品功效、環(huán)境壓力及深化產(chǎn)業(yè)鏈問題提高農(nóng)副產(chǎn)品附加值等問題，有的研究機構以動物臟器這些低值邊角料為原料研究制備生物活性肽，且生物活性顯著。生物活性肽的高效制備工藝是實現(xiàn)活性肽產(chǎn)業(yè)化的關鍵，雖然目前國內(nèi)外很多實驗室都在研究生物活性肽的制備工藝，但大規(guī)模生物活性肽的商品化應用依然存在著許多問題和障礙，所以研究者對于生物活性肽新型高效制備工藝和低成本、高純度、大批量生產(chǎn)的工程化研究也會越來越深入。生物活性肽的研究與開發(fā)仍具有廣闊的發(fā)展前景。

利用食源性的動物骨粉、骨泥制備生物活性肽[40-41]，尋找馴化適宜的益生菌，通過發(fā)酵制備骨多肽，然后對發(fā)酵產(chǎn)物按分子量大小進行分離，驗證各個多肽片段的功能，制備符合人體氨基酸比例的活性多肽是多肽研究的一個新選擇[42-44]。以食源性物質為原料制備活性肽時，首先保證人體食用的安全性，其次營養(yǎng)保健功能豐富，還可以增加動物骨骼的利用率，生化產(chǎn)業(yè)鏈，原料價廉易得，可很好地控制生產(chǎn)成本，益生菌發(fā)酵產(chǎn)品是現(xiàn)代養(yǎng)生保健的熱門話題，如風靡日本又傳入我國的納豆，就是大豆經(jīng)過納豆菌發(fā)酵而成的一種健康產(chǎn)品，益生菌[45-46]本身是平衡腸道微生態(tài)的有益菌群，發(fā)酵技術就是將生物體進行有機物分解的過程，動物骨泥經(jīng)過益生菌發(fā)酵分解成多種生物活性肽，可解決發(fā)酵法存在的安全問題和不可控性，這為生物活性肽的研究與開發(fā)提供了新的研究方向，同時為功能性保健食品的開發(fā)提供新原料和新思路。