黃春燕，郭惠東，楊 鵬，姚 強(qiáng)，韓建東，李 瑾，謝紅艷，宮志遠(yuǎn)

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，山東省農(nóng)業(yè)面源污染防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部廢棄物基質(zhì)化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100）

杏鮑菇（Pleurotus eryngii），又名刺芹側(cè)耳，是近年來新興的適宜工廠化栽培的大型肉質(zhì)食用菌。2017年杏鮑菇工廠化栽培產(chǎn)量占食用菌工廠化栽培總產(chǎn)量的35%，僅次于金針菇（Flammulina velutipes），居第2位[1]。由于栽培條件、栽培原料的不同，不同工廠引進(jìn)菌種后會(huì)有不同的栽培表現(xiàn)，因此在大規(guī)模生產(chǎn)前均需做適應(yīng)性馴化。劉欣等[2]對(duì)山西杏鮑菇主要菌株的栽培特性進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，分別篩選出適宜工廠化栽培和季節(jié)性栽培的菌株各一株。張疏雨[3]試驗(yàn)比較了11個(gè)杏鮑菇菌株，篩選出適合工廠化栽培的1個(gè)菌株以及可作為雜交親本的1個(gè)株菌株。為了篩選出適宜本地工廠化栽培的杏鮑菇菌株，以及為今后杏鮑菇菌株選育尋找適宜親本，本試驗(yàn)對(duì)收集引進(jìn)的21個(gè)杏鮑菇菌株進(jìn)行了比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1．1．1 供試菌株

供試菌株如表1所示。

表1 供試杏鮑菇菌株Tab．1 The tested strains of Pleurotus eryngii

1．1．2 供試培養(yǎng)基

復(fù)合PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、麥麩 10 g、蛋白胨 3 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0．5 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、玉米粉 2 g、蛋白胨 3 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0．5 g，水1 000 mL，pH自然。

栽培料：棉籽殼50%、玉米芯32%、麥麩15%、豆粕1%、石膏1%、白糖1%、磷肥1%，含水量65%。

1.2 試驗(yàn)方法

1．2．1 菌絲拮抗試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行。將各菌株接種于復(fù)合PDA平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一定時(shí)間后，在無菌條件下用直徑5 mm的打孔器，在培養(yǎng)好的平皿菌落上打取生長(zhǎng)一致的菌圓片備用，在空白平板培養(yǎng)基上，分別接種待檢菌株菌圓片進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，重復(fù)3次，恒溫培養(yǎng)，定期檢查有無拮抗反應(yīng)。

1．2．2 酯酶同工酶

參照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行。供試菌株接種于復(fù)合PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)7 d，刮取菌絲體0．5 g，放置于預(yù)冷研缽中，加入液氮將菌絲體研磨至粉末狀，然后轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，加入0．5 mL的Tris－HCl提取液，混勻，于 4℃、10 000 r·min－1條件下離心10 min，取上清液、40%蔗糖溶液和溴酚藍(lán)指示液以5∶1∶1的比例混合，即為電泳樣品，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用不連續(xù)垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度7%，濃縮膠濃度2．5%，上樣量10 μL，在4℃條件下穩(wěn)流電泳（1 mA·cm－1～2 mA·cm－1）。采用固藍(lán)RR鹽、乙酸－α萘酯、乙酸－β萘酯染色，使用7%醋酸溶液漂洗、固定凝膠。

1．2．3 栽培試驗(yàn)

采用工廠化袋栽方式進(jìn)行栽培，液體菌種接種。接種后待菌絲長(zhǎng)過袋肩2 cm后，于菌絲生長(zhǎng)邊緣劃起始線，5 d后于菌絲生長(zhǎng)邊緣劃終止線，量取兩線之間距離，計(jì)算菌絲日均生長(zhǎng)速度。子實(shí)體菌蓋伸展但邊緣內(nèi)卷（約八分成熟）時(shí)采收。統(tǒng)計(jì)各菌株第1潮菇的產(chǎn)量，計(jì)算生物轉(zhuǎn)化率。每個(gè)菌株隨機(jī)抽取10袋，測(cè)量子實(shí)體的菌柄長(zhǎng)度、菌柄直徑、菌蓋直徑、菌蓋厚度等指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏鮑菇不同菌株間菌絲拮抗反應(yīng)

對(duì)收集到的21株杏鮑菇菌株進(jìn)行了拮抗反應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)果見表2、圖1。

1號(hào)、4號(hào)、14號(hào)菌株與其他菌株間均存在明顯拮抗反應(yīng)，2號(hào)、3號(hào)、5號(hào)～13號(hào)、15號(hào)～21號(hào)相互之間不存在拮抗反應(yīng)。根據(jù)菌株間有無拮抗反應(yīng)的情況，可將21株杏鮑菇菌株分為4組，其中1號(hào)、4號(hào)、14號(hào)這三個(gè)菌株與其他所有菌株間都存在拮抗反應(yīng)，各自成1組，其余18個(gè)菌株相互間拮抗反應(yīng)均不明顯，可歸為1組。

2.2 杏鮑菇不同菌株酯酶同工酶分析

不同菌株酯酶同工酶酶譜如圖2所示，杏鮑菇酯酶同工酶電泳圖譜獲得的條帶較多，根據(jù)酯酶同工酶酶譜的有無，采用相似系數(shù)法進(jìn)行聚類分析，得到樹狀圖，見圖3。

由圖3可以看出，當(dāng)相似系數(shù)為0．9時(shí)，可以把供試菌株分為7組：1號(hào)、4號(hào)、14號(hào)菌株與其他菌株相比差異較大，各自為1組，2號(hào)、3號(hào)、5號(hào)、6號(hào)菌株聚為1組，10號(hào)、11號(hào)、12號(hào)、16號(hào)、17號(hào)、19號(hào)菌株聚為1組，13號(hào)、15號(hào)、18號(hào)、20號(hào)、21號(hào)菌株聚為1組，7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)菌株聚為1組。

表2 不同杏鮑菇菌株間拮抗反應(yīng)Tab.2 Antagonistic reaction among different strains of Pleurotus eryngii

圖1 部分杏鮑菇菌株間拮抗反應(yīng)Fig.1 Antagonism among some strains of Pleurotus eryngii

圖2 21個(gè)杏鮑菇菌株酯酶同工酶酶譜Fig.2 Esterase isozyme zymogram of 21 Pleurotus eryngii strains

圖3 21個(gè)杏鮑菇菌株酯酶同工酶聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of esterase isozyme cluster analysis of 21 Pleurotus eryngii strains

2.3 不同杏鮑菇菌株栽培試驗(yàn)

不同杏鮑菇菌株栽培試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 不同杏鮑菇菌株農(nóng)藝性狀比較Tab.3 Comparison of the agronomic characters of different Pleurotus eryngii strains

如表3所示，4號(hào)菌株菌絲生長(zhǎng)速度最慢，為4.16 mm·d-1，9號(hào)菌絲生長(zhǎng)速度最快，為5.16 mm·d-1，大多數(shù)菌株菌絲間生長(zhǎng)速度差異不大，平均速度為4.67 mm·d-1。供試菌株的子實(shí)體性狀主要分為近保齡球狀、棒狀和近棒狀。1號(hào)、4號(hào)、14號(hào)菌株均為近保齡球狀，菌蓋稍大，生物轉(zhuǎn)化率較低；其余菌株多為棒狀或近棒狀，一般子實(shí)體為棒狀的菌株產(chǎn)量均較高。這可能與工廠化生產(chǎn)對(duì)菌蓋小、菌柄粗且長(zhǎng)菌株的定向篩選有關(guān)。通過對(duì)菌株生長(zhǎng)周期、子實(shí)體農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量等一系列性狀的比較，3號(hào)、9號(hào)菌株綜合性狀較好，可作為工廠化生產(chǎn)的優(yōu)良杏鮑菇菌株進(jìn)行進(jìn)一步的馴化選育。

3 小結(jié)

真菌的拮抗反應(yīng)是體細(xì)胞不親和的直接體現(xiàn)，也是最常用的食用菌菌種鑒定方法[4]。同工酶是基因在代謝水平上的表型，可以作為生化指標(biāo)，已被廣泛應(yīng)用于食用菌種間、種內(nèi)的分類鑒定[5-7]。本研究表明運(yùn)用拮抗反應(yīng)和酯酶同工酶分析杏鮑菇菌株之間的差異性，二者吻合度較高，具有拮抗反應(yīng)的菌株，其酯酶同工酶酶譜差別也較大，但酯酶同工酶譜對(duì)菌株的區(qū)分更為精確，可以將沒有拮抗反應(yīng)的菌株進(jìn)行進(jìn)一步的區(qū)分。大多數(shù)商品化栽培菌株的親緣關(guān)系較近，可能與品種間頻繁地交流和相互引進(jìn)有關(guān)。

工廠化栽培要求菌株具有菌絲生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、耐儲(chǔ)運(yùn)的特性。本試驗(yàn)中3號(hào)菌株與9號(hào)菌株菌絲生長(zhǎng)速度較快，栽培周期中等，產(chǎn)量較高，子實(shí)體形態(tài)為棒狀，菌蓋較小有利于儲(chǔ)運(yùn)，可作為工廠化栽培的備選品種進(jìn)行進(jìn)一步馴化改良。1號(hào)、4號(hào)、14號(hào)菌株與其他菌株之間差異明顯，可用作雜交育種材料，以望獲得性狀互補(bǔ)的優(yōu)良菌株。