謝海彬，王幫慶，解修超，趙赟鑫，馬明元，鄧百萬**

（1．漢中植物研究所，陜西 漢中 723000；2．陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；3．陜西森盛菌業(yè)科技有限公司，陜西 勉縣 724200）

黑木耳（Auricularia auricula） 是我國栽培最早的食用菌，營養(yǎng)保健價值高，為我國第三大食用菌，產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速[1－4]。秦巴山區(qū)地理位置優(yōu)越，黑木耳種質(zhì)資源和林木資源豐富，但符合區(qū)域特點的黑木耳品種缺乏，亟需選育出優(yōu)良品種來滿足本地區(qū)黑木耳產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求?！吧?號”是通過野生黑木耳菌株分離與系統(tǒng)選育而成；經(jīng)過區(qū)域試驗和生產(chǎn)試驗，該品種具有中早熟、豐產(chǎn)、單耳、抗逆性強的特性，已經(jīng)通過陜西省農(nóng)作物品種審定委員會的審定。

1 材料和方法

1.1 菌株

試驗采用的8個菌株由分布于秦巴山區(qū)不同生態(tài)條件下的野生黑木耳標(biāo)本經(jīng)組織分離和純化培養(yǎng)獲得[5]，并以當(dāng)?shù)刂髟云贩NA268、新科5號為對照（CK），菌株具體來源見表1。

表1 試驗菌株來源Tab．1 Sources of test strains

1.2 選育過程

選育工作按常規(guī)育種程序進行，即從收集到的野生菌種資源開始，經(jīng)組織分離、菌種培養(yǎng)、生理性能測定、初篩、復(fù)篩、區(qū)別性鑒別、DUS（一致性和穩(wěn)定性）屬性研究等，綜合評價確定入選菌株[6]。

1．2．1 品種比較試驗

對分離的菌株首先通過菌絲生長速度和菌絲生長勢等指標(biāo)進行綜合評價，再通過袋栽方式進行品種比較試驗[7－10]。試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，每一個菌株為1個處理，每個處理100袋，設(shè)3次重復(fù)，記錄不同菌株菌絲生長情況。

1．2．2 區(qū)域試驗

2012年～2014年分別在寧強五郎廟（海拔約980 m）、勉縣張家河（海拔約1 190 m）、略陽縣九中金鄉(xiāng)中川壩村（海拔約860 m）、四川青川縣姚渡陽山村（海拔約490 m）、西鄉(xiāng)縣沙河鎮(zhèn)（海拔約580 m）等地布點，開展品種區(qū)域試驗。采用比較設(shè)計，設(shè)段木栽培50架，段木規(guī)格為長100 cm～120 cm，直徑8 cm～12 cm的闊葉樹木棒。以A91#為試驗菌株，當(dāng)?shù)刂髟云贩N耳268作為對照，栽培管理水平略高于當(dāng)?shù)厣a(chǎn)水平。以品種系統(tǒng)選育為主要方法，品比試驗后，將選出的表現(xiàn)優(yōu)良的菌株進行擴大試驗。

1.3 黑木耳A91#菌株生物學(xué)特性研究

1．3．1 拮抗反應(yīng)

拮抗反應(yīng)適用于異宗結(jié)合的真菌種類，不同種類的拮抗反應(yīng)形態(tài)特征不同，總體上可以分為隆起型 （ridgy）、溝型 （chimb） 和隔離型 （separate） 三大類型（NY/T1098－2006食用菌品種描述技術(shù)規(guī)范）。拮抗反應(yīng)有無的判斷依據(jù)為農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1845－2010食用菌菌種區(qū)別性鑒定拮抗反應(yīng)。二者間有拮抗反應(yīng)，則為不同品種。以選育的黑木耳新品種森盛1號為試驗菌株，以目前國內(nèi)部分黑木耳主栽品種為試驗對照，在CPDA培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)，分析黑木耳森盛1號新品種間的親緣關(guān)系。

1．3．2 蛋白質(zhì)電泳試驗

以選育的黑木耳新品種A91#為試驗菌株，目前國內(nèi)部分黑木耳主栽品種為對照進行液體培養(yǎng)，制備營養(yǎng)菌絲進行蛋白質(zhì)電泳試驗，測定黑木耳A91#新品種的親緣關(guān)系。在分離膠濃度為12．0%，濃縮膠濃度為5．0%的電泳條件下，對供試的10種黑木耳菌株的營養(yǎng)菌絲進行酯酶同工酶電泳，得到酯酶同工酶譜圖，依據(jù)酶譜中酶帶的差異繪制酯酶同工酶模式圖。

1．3．3 DNA 分子指紋圖譜研究

采用改進的CTAB法提取菌絲體基因組總DNA。選用通用引物ITS1和ITS4（TS1：5’－TCCGTAGGT GAACCTGC－3；ITS4：5’－TCCTCCGCTTATTGATAT GC－3’） 擴增 5．8S rDNA 及其兩側(cè)的 ITS1和 ITS2基因片段。將所測序列提交到NCBI進行Blast檢索，下載同源性較高的數(shù)據(jù)，生成Fasta格式的文件。用Clusta－X軟件對所得序列進行人工校正和比對分析。利用Mega5，按照N－J法聚類，選擇1 000個重復(fù)做Bootstrap值分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果分析

2.1 品種比較試驗結(jié)果

不同菌株菌絲生長情況見表2，不同菌株農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量比較見表3。

由表2和表3可以看出，通過系統(tǒng)篩選，黑木耳A91#菌株整體性狀表現(xiàn)優(yōu)良，菌株菌絲體潔白、濃密，菌落邊緣整齊、均勻，氣生菌絲發(fā)達，呈絨毛狀。品種比較試驗結(jié)果表明，A91#菌株菌絲體生長速度快，長勢強，出耳早，耳片單生，生物轉(zhuǎn)化率比對照（CK） 高11．81%，表現(xiàn)突出。

表2 菌株菌絲生長情況Tab．2 Mycelium growth condition of strains

表3 黑木耳菌株農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量比較Tab．3 Comparison of agronomic characters and yield of Auricularia auricula strains

2.2 區(qū)域試驗結(jié)果

黑木耳A91#段木栽培試驗產(chǎn)量結(jié)果見表4。

表4 黑木耳菌株A91#段木栽培試驗的產(chǎn)量Tab．4 Yield of the strain A91#of Auricularia auricula in cutlog cultivation trial

表4結(jié)果表明，A91#菌株在段木栽培生產(chǎn)試驗中，每架平均產(chǎn)量為5．716 kg（干重），比對照品種提高16．49%，增產(chǎn)顯著。

A91#菌株經(jīng)過品種比較試驗、區(qū)域試驗發(fā)現(xiàn)，該品種與目前在陜南毗鄰地區(qū)栽培的黑木耳品種相比，具有遺傳性狀穩(wěn)定，抗雜菌感染能力強，生物轉(zhuǎn)化率高，質(zhì)量好等優(yōu)點。

2.3 黑木耳A91#菌株生物學(xué)特性研究

2．3．1 拮抗反應(yīng)

黑木耳A91#菌株與部分黑木耳菌株的拮抗反應(yīng)結(jié)果見圖1。

圖1 A91#菌株與部分黑木耳菌株間的拮抗反應(yīng)Fig．1 Antagonistic response of A91#strain to some strains of Auricularia auricula

由圖1可以看出，對峙培養(yǎng)試驗顯示，黑木耳A91#菌株與當(dāng)?shù)卦耘嗟?個黑木耳栽培品種的菌絲間存在不同程度的拮抗反應(yīng)，其中與新科5號、秦單3#、秦單4#、國興1號間拮抗反應(yīng)呈隔離型，與耳801間拮抗反應(yīng)呈隆起型，與耳238、耳268、耳913間拮抗反應(yīng)呈溝型。說明黑木耳A91#菌株與目前主栽品種有差異。

2．3．2 黑木耳菌株A91#的蛋白質(zhì)電泳試驗

10種黑木耳菌株的酯酶同工酶譜圖見圖2。

圖2 10種黑木耳菌株的營養(yǎng)菌絲酯酶同工酶電泳圖譜Fig．2 Electrophoretic patterns of mycelial esterase isozymes of 10 strains of Auricularia auricula

圖2結(jié)果顯示，供試10種黑木耳菌株的酯酶同工酶酶活性均較高。電泳譜圖中共出現(xiàn)36條酯酶同工酶譜帶，每一菌株的酶帶在2條～5條之間，大多在3條～5條之間。其中，耳629、耳801都出現(xiàn)5個酯酶同工酶譜帶，耳238、913#和國興1號出現(xiàn)4個酯酶同工酶譜帶，A91#、耳268、秦單3#、新科1號出現(xiàn)3個酯酶同工酶譜帶，秦單4#譜帶最少，只有2個同工酶譜帶。10個黑木耳菌株出現(xiàn)10個不同的酶譜類型，沒有相同的酶譜類型，其中A91#和耳268、耳238和耳913菌株的帶型基本相同。10個供試菌株在Rf值0．615和0．510處都有2個共有酶帶，這可能是黑木耳菌種的特征酶帶。

2．3．3 黑木耳菌株A91#的DNA分子指紋圖譜研究

將新科1#、耳629、秦單3#等13個高同源性的序列與新菌株A91#的相關(guān)基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，見圖3。由圖3可見，A91#與黑木耳（NCBI登錄號：JN712676）基因序列上同聚為一族，其相似度最高；與黑木耳（NCBI登錄號HQ388383和HQ388355）距離較近。因此，本文所獲得的新菌株A91#是黑木耳菌株。

3 結(jié)論

通過系統(tǒng)選育篩選出具有目標(biāo)性狀的菌株A91#，定名“森盛1號”。該品種屬中熟品種，耳片單生，商品性狀好，抗雜菌能力強。3年的區(qū)域試驗和生產(chǎn)試驗表明，森盛1號段木栽培每架平均產(chǎn)量為5．716 kg，比對照品種提高16．49%；森盛1號袋料栽培每100千克干料平均產(chǎn)鮮耳82．166 kg，比對照品種平均高15．35%。

圖3 黑木耳菌株A91#和部分栽培種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．3 Phylogenetic trees of Auricularia auricula strain A91#and some cultivated strains

多年多點試驗表明，森盛1號具有品種新穎，豐產(chǎn)性好，抗逆性強，產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)的特點，符合非主要農(nóng)作物品種鑒定登記的條件，達到新品種審定要求。該品種于2015年7月8日通過了陜西省農(nóng)作物品種審定委員會辦公室非主要農(nóng)作物品種鑒定登記。通過上述生產(chǎn)試驗結(jié)果表明，森盛1號新品種可以進行推廣栽培。