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        紫外-可見分光光度法測(cè)定沙棘葉總黃酮 含量的優(yōu)化試驗(yàn)

        2018-09-21 06:55:10梁愛軍
        山西林業(yè)科技 2018年3期
        關(guān)鍵詞:葉總靜置定容

        梁愛軍

        (1.山西省林業(yè)科學(xué)研究院,山西 太原 030012;2.國(guó)家林業(yè)局沙棘工程技術(shù)研究中心,山西 太原 030012))

        沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.),胡頹子科沙棘屬落葉灌木,由于其耐旱、抗風(fēng)沙的特性,被廣泛應(yīng)用于水土保持造林中。沙棘是一種重要的藥食同源植物,其根、葉、花、果實(shí)、種子中含有黃酮、原花青素、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分,特別是沙棘葉中的黃酮類物質(zhì)遠(yuǎn)大于其它部位,被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明,沙棘黃酮具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化、降低血脂膽固醇水平、延緩衰老等作用。沙棘葉總黃酮的測(cè)定方法主要有分光光度法與高效液相色譜法。高效液相色譜法主要用于測(cè)定黃酮單體成分,具有精確度高、誤差小的優(yōu)點(diǎn),但操作復(fù)雜、檢測(cè)成本較高。分光光度法主要用于測(cè)定總黃酮含量,一般采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH為顯色體系,但對(duì)于NaNO2,Al(NO3)3,NaOH的加入量與顯色時(shí)間的文獻(xiàn)報(bào)道均不一致。因此,筆者對(duì)沙棘葉樣品溶液中總黃酮含量進(jìn)行分析比較,以期建立最優(yōu)的測(cè)定沙棘葉總黃酮含量的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        沙棘葉采自山西省關(guān)帝林局龍興林場(chǎng)(5月至10月混合);蘆丁、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑皆為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

        儀器有電子天平(青島紫泉儀器有限公司),鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊有限公司),電熱恒溫水浴鍋(上海博訊有限公司),紫外可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司),臺(tái)式離心機(jī)(賽歐斯天津科技有限公司)。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 原料預(yù)處理

        將沙棘葉于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥6 h,粉碎機(jī)粉碎,過80目篩后備用。

        1.2.2 樣品溶液的制備

        精確稱取5 g沙棘葉粉末,加60%乙醇50 mL,水浴加熱2 h,離心過濾,定容至100 mL容量瓶中。之后再?gòu)娜萘科恐腥?5 mL液體定容到50 mL容量瓶中備用。

        1.2.3 空白參比的選擇

        將樣品溶液、5%NaNO2溶液、10%Al(NO3)3溶液、4% NaOH溶液以不同組合方式,用30%乙醇定容至25 mL容量瓶中,于510 nm處測(cè)定吸光度值。

        1.2.4 稀釋定容乙醇濃度的選擇

        精確吸取1 mL樣品溶液于25 mL容量瓶中,分別用30%,40%,50%,60%,70%乙醇定容,于510 nm處測(cè)定吸光度值。

        1.2.5 顯色劑加入量的選擇

        精確吸取1 mL樣品溶液于25 mL容量瓶中,每次只改變一個(gè)劑量因素,用30%乙醇定容,于510 nm處測(cè)定吸光度值。

        1)加入4%NaNO2溶液0.3 mL,0.5 mL,0.7 mL,1.0 mL,10%Al(NO3)3溶液1 mL,4%NaOH溶液10 mL.

        2)加入4%NaNO2溶液1 mL,10%Al(NO3)3溶液0.3 mL,0.5 mL,0.7 mL,1.0 mL,4%NaOH溶液10 mL.

        3)加入4%NaNO2溶液1 mL,10%Al(NO3)3溶液1.0 mL,4%NaOH溶液4 mL,6 mL,8 mL,10 mL.

        1.2.6 顯色時(shí)間的選擇

        精確吸取1 mL樣品溶液于25 mL容量瓶中,每次只改變一個(gè)靜置時(shí)間因素,用30%乙醇定容,于510 nm處測(cè)定吸光度值。

        1)加入4% NaNO2溶液1 mL,靜置2 min,4 min,6 min,8 min,10 min;10% Al(NO3)3溶液1 mL,靜置6 min;4% NaOH溶液10 mL,靜置15 min.

        2)加入4% NaNO2溶液1 mL,靜置6 min;10% Al(NO3)3溶液1 mL,靜置2 min,4 min,6 min,8 min,10 min;4% NaOH溶液10 mL,靜置15 min.

        3)加入4% NaNO2溶液1 mL,靜置6 min;10% Al(NO3)3溶液1 mL,靜置6 min;4%NaOH溶液10 mL,靜置5 min,10 min,15 min,20 min,25 min.

        1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

        配置0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別吸取0 mL,1 mL,2 mL,3 mL,4 mL,5 mL,6 mL于25 mL容量瓶中,各加30%乙醇至6 mL.之后加入5%NaNO2溶液1 mL,搖勻靜置6 min.再加入10% Al(NO3)3溶液1 mL,搖勻靜置6 min.再加4%NaOH溶液10 mL,用30%乙醇定容至刻度,搖勻靜置15 min,于510 nm處測(cè)定吸光度。以X軸為蘆丁濃度,Y軸為吸光度,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.2.8 沙棘葉總黃酮的計(jì)算

        式中:w——沙棘葉總黃酮含量,mg/g;

        c——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的沙棘葉總黃酮濃度,mg/mL;

        v——提取液總體積,mL;

        d——稀釋倍數(shù);

        m——沙棘葉粉末質(zhì)量,g.

        2 結(jié)果與分析

        2.1 空白參比的選擇

        不同空白參比的吸光度見圖1.

        圖1 不同空白參比的吸光度

        由圖1可以看出,試劑空白亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉組(B+C+D)的吸光度值最低。由于樣品本身有顏色,試劑空白不能排除樣品中色素及一些其它有色雜質(zhì)的吸光度,會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏高。樣品溶液-亞硝酸鈉組(A+B)、樣品溶液-硝酸鋁組(A+C)的吸光度稍大于樣品溶液組(A)的吸光度,表明單獨(dú)加入亞硝酸鈉或硝酸鋁與樣品溶液中的少部分黃酮類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。樣品溶液-亞硝酸鈉-硝酸鋁組(A+B+C)的吸光度與樣品測(cè)定(A+B+C+D)的吸光度基本接近,表明同時(shí)加入亞硝酸鈉與硝酸鋁與樣品溶液中的大部分黃酮類物質(zhì)發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)。因此,選擇樣品溶液組(A)作為空白參比較好。

        2.2 稀釋定容乙醇濃度的選擇

        不同稀釋定容乙醇濃度的吸光度值見圖2.

        圖2 稀釋定容不同乙醇濃度的吸光度

        由圖2可知,用30%,40%,50%,60%乙醇定容的吸光度值基本相近,因此乙醇濃度對(duì)該方法的最終顯色影響不是很大。用70%乙醇定容的吸光度值稍高一些,可以選用70%乙醇稀釋定容。

        2.3 顯色劑加入量的選擇

        顯色劑加入量對(duì)吸光度值的影響見表1.

        表1 顯色劑加入量對(duì)吸光度值的影響

        由表1可以看出,顯色劑NaNO2,Al(NO3)3,NaOH的不同加入量對(duì)吸光度值的影響不顯著,說明顯色劑加入量的多少不影響吸光度值。為了節(jié)約試劑,選擇NaNO20.3 mL,Al(NO3)30.3 mL,NaOH 4 mL.

        2.4 顯色時(shí)間的選擇

        顯色劑顯色時(shí)間對(duì)吸光度值的影響見表2.

        表2 顯色劑顯色時(shí)間對(duì)吸光度值的影響

        由表2可知,NaNO2靜置時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果基本無影響,所以加入NaNO2后可直接加入Al(NO3)3,不必再搖勻靜置。加入Al(NO3)36 min后,吸光度值趨于穩(wěn)定,說明Al(NO3)3與黃酮類化合物的絡(luò)合反應(yīng)至少需要6 min才能完成。加入NaOH 10 min~15 min吸光度值基本沒變化,靜置25 min吸光度值減小。因此,加入NaOH后搖勻靜置10 min即可,最長(zhǎng)靜置20 min.

        2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

        通過測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值,繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖3.

        圖3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.6 沙棘葉總黃酮含量的測(cè)定

        在上述得出的最優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行測(cè)定,取1 mL樣液于25 mL容量瓶中,加入5% NaNO20.3 mL,加入10% Al(NO3)30.3 mL,搖勻靜置6 min.然后加入4% NaOH 4 mL,搖勻靜置10 min,用70%乙醇定容至刻度。以只加樣品溶液為空白參比,于510 nm處測(cè)定吸光度值,得到沙棘葉總黃酮提取率為1.94%,1.99%,2.10%,平均提取率為2.01%.

        3 討論

        用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系分光光度法測(cè)定沙棘葉總黃酮含量時(shí),空白參比、稀釋定容乙醇的濃度、試劑加入量與顯色時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果均有一定影響。因此,必須嚴(yán)格保證空白參比、稀釋定容乙醇的濃度、試劑加入量與顯色時(shí)間等試驗(yàn)環(huán)節(jié)前后完全一致,否則會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏高或偏低,出現(xiàn)較大的誤差。

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