程文棟 張娜

(青海省人民醫(yī)院呼吸科，青海 西寧810007)

慢性阻塞性肺疾病(Acute Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary Disease，AECOPD)常由細(xì)菌、病毒、環(huán)境污染物等誘發(fā)，并導(dǎo)致氣道炎癥及損傷。氣道表面上皮細(xì)胞損傷后反應(yīng)包括上皮細(xì)胞完整性的破壞、部分脫落，甚至是基底膜的完全脫落。隨后上皮修復(fù)、再生并恢復(fù)功能，其機(jī)制涉及上皮基底細(xì)胞的遷移、上皮細(xì)胞的增殖與分化等。探討支氣管上皮細(xì)胞在AECOPD發(fā)生中的功能改變，對(duì)于AECOPD發(fā)病機(jī)制的研究十分重要。為研究CEACAM1對(duì)支氣管上皮細(xì)胞功能的影響，本實(shí)驗(yàn)探討CEACAM1對(duì)HBE細(xì)胞的增殖、遷移以及炎癥因子產(chǎn)生等方面的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞系：人支氣管上皮細(xì)胞株HBE來(lái)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。主要試劑：IFN-γR&D Systems 公司；siRNA-CEACAM1GenePharma公司；siRNA-NCGenePharma公司；lipofectamin2000Invitrogen公司；Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco公司；RPMI-1640培養(yǎng)基Hyclone 公司；二甲亞諷(DMSO)Sigma公司；Trizol ReagentInvitrogen公司 ；DNase (RNase Free) water Invitrogen公司Sangon 公司 ；PrimeScript RT reagent KitTaKaRa公司；SYBR Premix Ex TaqTaKaRa公司；引物合成Sangon 公司；CCK-8試劑盒Beyotime 公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 siRNA轉(zhuǎn)染 HBE細(xì)胞 轉(zhuǎn)染方法按Lipofectamine 2000產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前1天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，將1×105個(gè)HBE細(xì)胞接種于24孔板(6孔板4×105個(gè))，每孔內(nèi)加入 500μl(6 孔板 2ml)無(wú)抗生素的 1640 培養(yǎng)基。Lipofectamine2000輕輕搖勻。按照每孔取1μl(6孔板4μl)Lipofectamine2000加入 50μl(6孔板 200μl)Opti-MEM I Reduced Serum Medium比例稀釋，輕輕混勻后，室溫孵育5min。按照每孔2μl(6孔板8μl)siRNA加入 50μl(6孔板 200μl)Opti-MEM I Reduced Serum Medium比例稀釋，輕輕混勻后。5min后，將稀釋的Lipofectamine2000 與稀釋的 siRNA混合，輕輕混勻，室溫靜置20min，以形成siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合物。將 siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合液加入含細(xì)胞及培養(yǎng)液的孔內(nèi)，輕輕搖晃孔板混勻。置于37℃、5%CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6小時(shí)后更換為含血清的1640培養(yǎng)基。

1.2.2 Real-time PCR PCR檢測(cè)引物如下：CEACAM1：Forward Primer：5’-GCTGGCATTGTGATTGGAGTA-3’；Reverse Primer：5’-TTAGGTGGGTCATTGGAGTG-3’；IL-6：Forward Primer：5’-GACAGCCACTCACCTCTTCAG-3’；Reverse Primer：5’-CATCCATCTTTTTCAGCCATC-3’；IL-8：Forward Primer：5’-TTGCCAAGGAGTGCTAAAGAA-3’；Reverse Primer：5’-GCCCTCTTCAAAAACTTCTCC-3’；MCP-1：Forward Primer：5’-AGGAACCGAGAGGCTGAGA-3’；Reverse Primer：5’-GGAATGAAGGTGGCTGCTAT-3’；TGF-β：Forward Primer：5’-GCCAGAGTGGTTATCTTTTGATG-3’；Reverse Primer：5’-AGTGTGTTATCCCTGCTGTCAC-3’；VEGF：Forward Primer：5’-AGGGCAGAATCATCACGAAGT-3’；Reverse Primer：5’-AGGGTCTCGATTGGATGGCA-3’。具體實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.3 細(xì)胞劃痕試驗(yàn) HBE細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板，轉(zhuǎn)染 siRNA并用IFN-γ刺激24小時(shí)后，觀察細(xì)胞達(dá)完全匯片。 用 10μl槍頭比著直尺，每孔劃出“+”字型兩道劃痕。 用PBS清洗細(xì)胞3次，盡量沖去劃痕中漂浮的細(xì)胞。 加入無(wú)血清培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h于倒置顯微鏡下觀察，并拍照。計(jì)算劃痕面積，按以下公式計(jì)算劃痕愈合度：愈合度=(S0-St) /S0×100%(S0：0時(shí)間點(diǎn)時(shí)的劃痕面積；St：測(cè)定時(shí)間點(diǎn)時(shí)的劃痕面積)。

1.2.4 CCK-8(Cell Counting Kit-8)測(cè)定細(xì)胞增殖 HBE細(xì)胞培養(yǎng)于 96孔板內(nèi)，轉(zhuǎn)染 siRNA，并分別于 IFN-γ 刺激 0h、24h、48h、72h進(jìn)行檢測(cè)。每孔內(nèi)加入CCK-8 溶液 10μl。于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～2h。置于酶標(biāo)儀，于450nm檢測(cè)吸光度，吸光度與細(xì)胞數(shù)目呈線性相關(guān)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)軟件用SPSS16.0，多組差別比較用單因素方差分析(One-way ANOVA test)，結(jié)果以±表示，兩組間差別比較用Student’s t-test 檢驗(yàn)進(jìn)行，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFN-γ作用HBE細(xì)胞24小時(shí)后IL-6、IL-8、TGF-β、VEGF的表達(dá) IFN-γ作用于HBE細(xì)胞24小時(shí)后進(jìn)行Real-timePCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)IL-6及IL-8顯著上調(diào)，而TGF-β與VEGF無(wú)顯著變化。因此選擇IL-6及IL-8進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表1。

注：與HBE組相比，①P<0.05

2.2 siRNA干擾CEACAM1表達(dá)后IFN-γ作用HBE細(xì)胞24小時(shí)IL-6、IL-8的表達(dá) 用不同濃度IFN-γ刺激HBE細(xì)胞24小時(shí)，可見(jiàn)陰性參照(NC組)IL-6與IL-8的mRNA表達(dá)水平均有所升高。而siRNA干擾(CEACAM1組)的IL-6與IL-8表達(dá)水平與IFN-γ刺激無(wú)關(guān)，且與同等濃度IFN-γ刺激的NC組相比，其表達(dá)水平顯著下降。提示IFN-γ誘導(dǎo)IL-6與IL-8表達(dá)有賴于CEACAM1的存在，見(jiàn)表2。

2.3 細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 轉(zhuǎn)染siRNA-CEACAM1干擾CEACAM1表達(dá)后，與空白對(duì)照及siRNA-NC組相比，HBE細(xì)胞劃痕愈合變慢。計(jì)算愈合度并繪制曲線發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組與siRNA-NC組愈合度隨時(shí)間變化增長(zhǎng)幅度相近，而siRNA-CEACAM1組相比NC組及空白對(duì)照組，其愈合度明顯較低。提示CEACAM1可促進(jìn)HBE細(xì)胞的遷移，見(jiàn)表3，圖1。

表2HBE細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-CEACAM1后IFN-γ作用24小時(shí)IL-6、IL-8表達(dá)

Table2ExpressedbyIL-6andIL-8ofHBEcellstransfectedwithsiRNA-CEACAM1byIFN-γ

組別IL-6IL-8IFN-γ 0ng/ml NC組1.99±0.061.02±0.04 siRNA-CEACAM12.65±0.171.93±0.25IFN-γ 10ng/ml NC組5.98±0.24①②3.02±0.14①② siRNA-CEACAM12.24±0.181.89±0.12

注：與ong/ml NC組相比，①P<0.05；與0ng/ml IFN-γ相比，②P<0.05

表3 各組細(xì)胞劃痕面積計(jì)算所得愈合度(×10-2)Table 3 The healing degree calculated with scratch area

注：與對(duì)照組相比，①P<0.05；與NC組相比，②P<0.05

圖1 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)觀察CEACAM1對(duì)HBE細(xì)胞遷移的影響(×40)Figure 1 Effect of CEACAM1 on migration of HBE cells

2.4 CCK-8試驗(yàn)測(cè)定CEACAM1對(duì)HBE細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染siRNA-CEACAM1及NC組與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞增長(zhǎng)率明顯減慢。而比較NC組與siRAN-CEACAM1組發(fā)現(xiàn)，在24小時(shí)時(shí)幾乎無(wú)差異，但在48小時(shí)開(kāi)始兩組間差異明顯(P<0.05)，siRNA-CEACAM1組細(xì)胞增長(zhǎng)率較NC組顯著減慢，因此認(rèn)為siRNA-CEACAM1可減慢HBE細(xì)胞增殖，從而提示在IFN-γ環(huán)境下，CEACAM1可促進(jìn)HBE細(xì)胞的增殖，見(jiàn)表4。

表4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增長(zhǎng)率(×10-2)Table 4 CCK-8 test detected cell growth rate

注：與對(duì)照組相比，①P<0.05；與NC組相比，②P<0.05

3 討論

COPD急性加重往往伴隨著細(xì)菌、病毒等病原體的感染或環(huán)境污染物的吸入等所導(dǎo)致的氣道炎癥反應(yīng)。以往的研究發(fā)現(xiàn)，在AECOPD患者的外周血及肺組織中，有多種炎癥因子的水平發(fā)生顯著變化[1-2]。其中白介素-6(interleukin-6, IL-6)、白介素-8(interleukin-8, IL-8)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)等炎癥因子，均被發(fā)現(xiàn)與AECOPD密切相關(guān)。

與穩(wěn)定期COPD患者或健康人群相比，IL-6水平在AECOPD患者外周血及痰標(biāo)本中均顯著升高[3]，并且與COPD嚴(yán)重程度密切相關(guān)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，在病毒或流感嗜血桿菌感染的小鼠中，IL-6明顯升高[5]。Jacques等在巨噬細(xì)胞中抑制CEACAM1表達(dá)后IL-6的水平無(wú)明顯改變，因此提出IL-6的表達(dá)不依賴于CEACAM1[6]。而我們的研究發(fā)現(xiàn)，在HBE細(xì)胞中抑制CEACAM1后 IL-6表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低，提示在HBE細(xì)胞中，IFN-γ通過(guò)誘導(dǎo)CEACAM1表達(dá)從而上調(diào)IL-6。

AECOPD患者中，血漿IL-8在內(nèi)的趨化因子水平也有所升高[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，在微血管內(nèi)皮中CEACAM1過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致IL-8的升高[8]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，抑制CEACAM1的表達(dá)可阻斷IFN-γ誘導(dǎo)的IL-8水平升高，提示IFN-γ是通過(guò)上調(diào)CEACAM1水平從而誘導(dǎo)IL-8的表達(dá)。VEGF在COPD患者外周血中的表達(dá)也有所升高[9]，尤其是在慢支型COPD患者中[10]。并且VEGF水平的升高與FEV1數(shù)值呈負(fù)相關(guān)，認(rèn)為VEGF參與氣道重塑[11]，而從急性期恢復(fù)后VEGF降低至穩(wěn)定期水平[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，在微血管內(nèi)皮中CEACAM1過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致VEGF的升高，并推測(cè)CEACAM1具有促進(jìn)血管生成的作用[8]。TGF-β也被認(rèn)為參與AECOPD的發(fā)生，TGF-β/smad 信號(hào)通路與COPD患者氣道炎癥及氣道重塑的發(fā)生密切相關(guān)[12]。而在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，IFN-γ作用HBE細(xì)胞后對(duì)VEGF或TGF-β無(wú)顯著的調(diào)控作用，因此我們推測(cè)VEGF與TGF-β的表達(dá)不依賴IFN-γ的作用。

AECOPD的病理過(guò)程中，除了炎癥因子水平的變化，還涉及氣道表面的上皮細(xì)胞在損傷后的一系列反應(yīng)，包括上皮細(xì)胞完整性的破壞、脫落以及損傷后修復(fù)、再生及功能重建。這一過(guò)程中涉及基底細(xì)胞的遷移、上皮細(xì)胞的增殖與分化等。在COPD患者氣道上皮的損傷修復(fù)過(guò)程中，常常伴隨氣道上皮的重塑，例如鱗化、粘液腺增生等，從而很大程度上破壞氣道上皮的固有免疫功能。在氣道上皮損傷修復(fù)的再上皮化過(guò)程中，氣道上皮細(xì)胞的遷移是首先發(fā)生的變化。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠皮膚傷口愈合試驗(yàn)中，CEACAM1敲除小鼠的傷口愈合過(guò)程明顯延長(zhǎng)[13]，提示CEACAM1可促進(jìn)皮膚細(xì)胞的遷移再生。我們?cè)隗w外培養(yǎng)的HBE細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞劃痕試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用siRNA干擾CEACAM1表達(dá)可顯著延緩細(xì)胞劃痕的愈合速度，提示CEACAM1可促進(jìn)HBE細(xì)胞的遷移，從而促進(jìn)上皮細(xì)胞損傷修復(fù)。

CEACAM1對(duì)細(xì)胞增殖的作用目前尚無(wú)統(tǒng)一的結(jié)論。在腫瘤中，CEACAM1對(duì)腫瘤增殖的作用取決于其L與S亞型的比例，不同CEACAM1亞型表現(xiàn)出對(duì)腫瘤生長(zhǎng)截然不同的作用，CEACAM1-L亞型抑制腫瘤生長(zhǎng)，而CEACAM1-S相反。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，也同樣發(fā)現(xiàn)CEACAM1對(duì)細(xì)胞增殖的作用與其亞型比例有關(guān)[14-18]。利用抗CEACAM1抗體阻斷培養(yǎng)于含血清培養(yǎng)基中的膀胱癌細(xì)胞NBT-II 的CEACAM1表達(dá)，可刺激Erk 活化，降低p27表達(dá)，并誘導(dǎo)DNA合成；而在無(wú)血清培養(yǎng)基中則表現(xiàn)出相反的結(jié)果，提示CEACAM1對(duì)于持續(xù)暴露于生長(zhǎng)因子環(huán)境下的細(xì)胞具有接觸抑制作用，而對(duì)于缺乏生長(zhǎng)因子的細(xì)胞則可共活化生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的細(xì)胞增殖[19-21]。在我們的研究中，采用siRNA干擾CEACAM1并應(yīng)用IFN-γ刺激，檢測(cè)HBE細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA-CEACAM1抑制CEACAM1后HBE細(xì)胞增長(zhǎng)率降低，提示CEACAM1具有促進(jìn)HBE細(xì)胞增殖的作用。

4 結(jié)論

本文研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ可通過(guò)誘導(dǎo)CEACAM1表達(dá)而上調(diào)HBE細(xì)胞IL-6 及 IL-8等炎癥因子的表達(dá)。提示CEACAM1可促進(jìn)HBE細(xì)胞遷移及細(xì)胞增殖，因此，可能具有促進(jìn)氣道上皮損傷修復(fù)的功能。