,3 ,3 李軍*

1.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；2.思南田氏民族傳統(tǒng)骨傷醫(yī)院，貴州 銅仁 5651003.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；4.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004；

乳沒活絡(luò)散源于貴州省土家族民族處方，由三七、沒藥、乳香和制川烏等十味中藥制成的散劑，具有活血化瘀、舒經(jīng)活絡(luò)、消腫止痛，促進(jìn)骨折愈合功能，用于氣滯血瘀型骨折、腫脹、瘀斑、肢節(jié)活動(dòng)障礙等疾病，民間藥用歷史已有兩百余年，臨床療效確切。貴州省思南田氏民族傳統(tǒng)骨傷醫(yī)院根據(jù)該驗(yàn)方開發(fā)了醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑(批準(zhǔn)文號(hào)：黔藥制字Z20170134)，該制劑已臨床使用三十余年，療效顯著，深受患者歡迎。為有效控制乳沒活絡(luò)散的質(zhì)量，本研究擬以乳沒活絡(luò)散中主藥三七的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1為特征性指標(biāo)成分，建立乳沒活絡(luò)散的含量測(cè)定控制方法，并對(duì)乳沒活絡(luò)散的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

1 儀器與材料

1.1 儀器 ULmate3000高效液相色譜儀(美國Thermo公司)，LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)；TGL-16G高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；AE240十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.2 材料 乳沒活絡(luò)散(批號(hào)：20160113、20160116、20160121、20170708、20170712、20170915，規(guī)格：20g/袋)；人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào)：110703-201529)、人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào)：110704-201424)和三七皂苷R1對(duì)照品(批號(hào)：110745-201318)均購自中國藥品生物制品鑒定所；乙腈(色譜純，天津科密歐化學(xué)制劑有限公司)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 分別稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1對(duì)照品10.67，18.91，21.68 mg，置10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得每1 mL含三七皂苷R11.067 g/L、人參皂苷Rg11.891 g/L和人參皂苷Rb12.168 g/L的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.4、0.8、1.6、2 mL分別置5個(gè)5 mL量瓶中，分別加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1系列對(duì)照品工作液。

2.1.2 供試品溶液及缺三七藥材陰性對(duì)照液的制備 取乳沒活絡(luò)散供試品1 g，精密稱定，置索式提取器中，加乙醚50 mL，加熱回流1 h，放冷，棄去乙醚液，藥渣揮干，加甲醇50 mL，加熱回流5 h，放冷，提取液蒸至近干，殘?jiān)影痹囈?0 mL使溶解，移置分液漏斗中，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水20 mL洗滌1次，分取正丁醇液，蒸至近干，殘?jiān)眠m量50 %甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。另取按本品制備工藝制備的缺三七藥材陰性制劑1 g，精密稱定，同法制備陰性對(duì)照液。

2.2 色譜條件及專屬性考察 色譜柱：Inertsil ODS-3(4.6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脫，洗脫程序(0～12 min，19%A；12～32 min，19%～30%A；32～40 min，30%A；40～54 min，30%～38%A；54～60 min，38%A)；流速：1.0 mL/min；柱溫45℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。在該色譜條件下，各色譜峰與樣品中其他組分色譜峰達(dá)基線分離，三七皂苷R1理論板數(shù)大于79000，如圖1所示。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對(duì)照品系列工作液10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，分別計(jì)算線性回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 線性范圍考察

2.4 精密度試驗(yàn)

2.4.1 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定取本品0.5，1，1.5 g，照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液10 μL進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算平均含量。每個(gè)稱量做3個(gè)平行。在取樣為0.5～1.5 g時(shí)，三七皂苷R1，平均含量為0.1054%，RSD為1.7%(n=9)；人參皂苷Rg1平均含量為0.5781%，RSD為1.9%(n=9)；人參皂苷Rb1平均含量為0.5234%，RSD為1.4%(n=9)。表明在稱量0.5～1.5 g范圍內(nèi)該方法重復(fù)性良好。

2.4.2 中間精密度 以不同的實(shí)驗(yàn)人員在不同時(shí)間按供試品溶液制備方法分別制備3份供試品溶液并測(cè)定。三七皂苷R1平均含量為0.1061%，RSD為1.6%(n=6)；人參皂苷Rg1平均含量為0.5788%，RSD為1.8%(n=6)；人參皂苷Rb1的平均含量為0.5202%之間，RSD為2.0%(n=6)。測(cè)定結(jié)果顯示表示方法的中間精密度良好。

2.5 加樣回收率 取已測(cè)定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和含量的制劑(三七皂苷R10.1054%，人參皂苷Rg10.5781%，人參皂苷Rb10.5234%)0.5 g，精密稱定，每個(gè)稱量平行3份，分別按所取樣品量中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1質(zhì)量數(shù)的50%、100%和150%的量精密加入對(duì)照品，照供試品溶液制備方法制備供試液，測(cè)定結(jié)果顯示三種被測(cè)定化合物的回收率在99.78%～101.4%之間，RSD在1.3 %～2.5%(n=9)之間，說明加樣回收率良好。

2.6 耐用性試驗(yàn) 為考察所建立的分析方法耐用性，對(duì)供試品溶液的穩(wěn)定性、不同色譜柱溫、不同檢測(cè)波長(zhǎng)、不同流速、不同品牌色譜柱、不同品牌的儀器分別進(jìn)行考察。

2.6.1 供試品溶液穩(wěn)定性考察 取同一供試品，按供試品溶液制備方法制備供試液，分別于0、2、4、8、24 h進(jìn)樣，結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1峰面積的RSD分別為0.62%～1.5%(n=5)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.2 不同色譜柱分析結(jié)果比較 按擬定的色譜條件，用Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm, 5 μm)、Phenomonex C18(4.6 mm×250 mm, 4 μm)和伊利特C18(5.0 mm×200mm, 5 μm)3種色譜柱對(duì)同一批號(hào)供試品進(jìn)行測(cè)定。三七皂苷R1平均含量為0.1056%，RSD為2.2%(n=6)；人參皂苷Rg1平均含量為0.5784%(n=6)，RSD為1.5%(n=6)；人參皂苷Rb1的平均含量為0.5233%，RSD為1.9%(n=6)。

2.6.3 不同流速測(cè)定結(jié)果比較 以Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱，以相同的流動(dòng)相和洗脫梯度條件，分別按0.95、1.00和1.05 mL/min不同流速的進(jìn)行分析。三七皂苷R1平均含量為0.1079%，RSD為2.7%(n=9)；人參皂苷Rg1平均含量為0.5790%，RSD為1.0%(n=9)；人參皂苷Rb1的平均含量為0.5201%之間，RSD為2.3%(n=9)。結(jié)果表明三種流速測(cè)試的結(jié)果基本一致。

2.6.4 不同柱溫測(cè)定結(jié)果比較 以Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱，按相同梯度和流速進(jìn)行洗脫，分別33℃、35℃、和37℃進(jìn)行分析。三七皂苷R1平均含量為0.1110%，RSD為2.2%(n=9)；人參皂苷Rg1平均含量為0.5790，RSD為1.7%(n=9)；人參皂苷Rb1的平均含量為0.5264%，RSD為1.0%～2.6%(n=9)。

2.6.5 不同檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果比較 以Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱，分別以201 nm、203 nm和205 nm進(jìn)行檢測(cè)，其余色譜條件不變進(jìn)行測(cè)定。三七皂苷R1平均含量為0.1107%，RSD為1.7%(n=9)；人參皂苷Rg1平均含量為0.5974%，RSD為2.0%(n=9)；人參皂苷Rb1的平均含量為0.5285%之間，RSD為2.3%(n=9)。結(jié)果表明波長(zhǎng)的小幅變動(dòng)對(duì)測(cè)定結(jié)果基本不影響。

2.6.6 不同型號(hào)儀器分析結(jié)果比較 按擬定的色譜條件，采用Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱，以Thermo ULmate3000和島津 LC-20AD高效液相色譜儀對(duì)同一批號(hào)供試品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果三七皂苷R1平均含量為0.1092%，RSD為1.7%(n=6)；人參皂苷Rg1平均含量為0.5790%，RSD為1.3%(n=6)；人參皂苷Rb1的平均含量為0.5248%，RSD為2.3%(n=6)。

2.6.7 制劑中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量測(cè)定 取三批次乳沒活絡(luò)散，按照本方法進(jìn)行樣品處理和成分測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 乳沒活絡(luò)散中三種成分測(cè)定結(jié)果 (%，n=2)

2. 7 乳沒活絡(luò)散穩(wěn)定性研究

2.7.1 加速穩(wěn)定性考察 取模擬醫(yī)院制劑包裝樣品(20160113、20160116和20160121批次)，置溫度(40±2)℃，相對(duì)濕度75%±5%，分別于0、1、2、3、6月取樣進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果表明，本品所測(cè)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過6個(gè)月加速試驗(yàn)考察，制劑中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量沒有明顯變化，分別為0.1075%～0.1119%、0.5567%～0.5661%和0.5012%～0.5148%，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.7.2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察 取模擬醫(yī)院制劑包裝樣品，室溫貯藏24個(gè)月。分別于0、3、6、9、12、18、24月取樣進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果表明，本品所測(cè)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)室溫留樣長(zhǎng)期試驗(yàn)24個(gè)月，制劑中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量沒有明顯變化，分別為0.1055%～0.1108%、0.5517%～0.5613%和 0.4981%～0.5118%，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 討論

乳沒活絡(luò)散由十味藥材組成，直接采用甲醇提取正丁醇萃取方法制備得到的供試品溶液雜質(zhì)多，干擾嚴(yán)重，被測(cè)成分分離度達(dá)不到要求，同時(shí)，對(duì)色譜柱污染嚴(yán)重，因此需要進(jìn)一步凈化樣品。根據(jù)皂苷類化合物理化性質(zhì)，先采用乙醚去除制劑中的脂溶性成分，再用甲醇提取制劑三七中皂苷類化合物，將甲醇提取液蒸至近干后，殘?jiān)冒痹囈喝芙?，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取皂苷類成分，除去酚酸類酸性成分，所得的供試品溶液進(jìn)樣分析時(shí)被測(cè)成分分離良好，雜質(zhì)不干擾測(cè)定。

目前測(cè)定三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量的方法多采用高效液相色譜法梯度洗脫[1-8]，選用紫外檢測(cè)器[1-5]、蒸發(fā)光檢測(cè)器[6-8]進(jìn)行測(cè)定。也有用超高效液相色譜法[9]測(cè)定其含量，但該法對(duì)儀器要求比較高，設(shè)備較昂貴，不易普及。本研究參考文獻(xiàn)報(bào)道[1-5]，在《中國藥典》[10]方法的基礎(chǔ)上針對(duì)本方進(jìn)行了不同色譜柱、不同流速等條件的改良測(cè)定，建立了從供試品制備到樣品檢測(cè)的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量測(cè)定方法。結(jié)果證明該法具有樣品處理簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)、靈敏度高，重復(fù)性好等特點(diǎn)，可以作為乳沒活絡(luò)散的質(zhì)量控制方法。在乳沒活絡(luò)散穩(wěn)定性試驗(yàn)中，除三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量測(cè)定外，還分對(duì)外觀性狀、鑒別、各項(xiàng)檢查及微生物等指標(biāo)進(jìn)行了考察，結(jié)果均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，說明本品在24 個(gè)月內(nèi)質(zhì)量穩(wěn)定，直接接觸藥品的包裝對(duì)藥品質(zhì)量無影響，故乳沒活絡(luò)散的有效期暫定為24 個(gè)月。