班若男，康興興，張圣燕

(濱州學(xué)院 化工與安全學(xué)院，山東 濱州 256600)

冬棗果實不僅營養(yǎng)豐富，其葉中含有大量有益人體健康的成分，如總黃酮、甜味抑制劑等。其中總黃酮不僅具有較強的天然抗氧化性和較強的自由基清除性，同時還有抗過敏、抗病毒、抗輻射及增強免疫能力等廣譜的生理活性[1]，而冬棗葉的再利用率卻不高。目前總黃酮的提取方法主要有溶劑提取法[2-3]、微波輔助提取法[4-5]、超聲輔助提取法[6-7]、酶解法[8]和超臨界萃取法[9]等，但關(guān)于冬棗葉中總黃酮提取工藝的研究鮮有報道，本文將超聲波和纖維素酶聯(lián)合使用，采用超聲波輔助酶解法提取冬棗葉中的總黃酮，研究提取條件對總黃酮提取率的影響，優(yōu)化提取工藝，探索出了一條提取率較高的實驗方案，為冬棗葉的開發(fā)再利用提供理論基礎(chǔ)，以充分利用我國的物質(zhì)資源。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器和試劑

Agilent8451紫外分光光度計；電熱恒溫水浴鍋；雙頻數(shù)控超聲波清洗器；電子分析天平。

冬棗葉；蘆丁 (AR)；纖維素酶 (30 units/mg)，無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、石油醚均為分析純。

1.2 實驗方法

冬棗葉洗凈、烘干、粉碎、脫脂、干燥后密封備用。

準確稱取預(yù)處理好的冬棗葉粉末1.0 g于碘量瓶中，加入乙醇液和纖維素酶，超聲酶解，趁熱過濾，得總黃酮粗提取液。

1.3 分析方法

1.3.1 標準曲線的繪制

總黃酮的結(jié)構(gòu)與蘆丁較為相似，故以蘆丁為標樣，測定總黃酮的含量。

準確稱取蘆丁標準品10.92 mg，用70%乙醇溶解后定容至50 mL容量瓶中，作為標準品溶液。

準確量取蘆丁標準液0.0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，分別加入0.3 mL的5%的亞硝酸鈉，0.3 mL的10%硝酸鋁溶液和4.0 mL的4%的氫氧化鈉溶液，用70%乙醇溶液定容，搖勻，靜置。以試劑空白為參比，在508 nm波長下測吸光度，作蘆丁Re濃度-吸光度標準曲線，得回歸方程為A=13.02913C+0.00101，其線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。

1.3.2 冬棗葉中總黃酮含量分析

將總黃酮粗提液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，70%乙醇定容，搖勻，待用。

準確量取3.0 mL定容液于10 mL容量瓶中，加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，10%的硝酸鋁溶液0.3 mL和4%的氫氧化鈉溶液4.0 mL，定容，搖勻，靜置后，以空白作參比，在508 nm波長下測吸光度，并根據(jù)標準曲線方程計算總黃酮濃度，算出提取率。

式中，C—總黃酮濃度(mg/mL)。

2 結(jié)果討論

2.1 提取溫度對總黃酮提取率的影響

提取時間為1.5 h，纖維素酶用量為3 mg/g，料液比為1∶40 (g/mL)，超聲功率為300 W，提取溫度對冬棗葉中總黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 提取溫度對總黃酮提取率的影響曲線

由圖1可看出，隨著提取溫度升高，總黃酮的提取率隨之升高。當提取溫度達到55℃時，總黃酮提取率達到最高，繼續(xù)升高溫度，總黃酮的提取率顯著降低。這是因為溫度較低時，纖維素酶的反應(yīng)活性較低，酶解效果較差；隨溫度升高，活性逐漸增大，提取率升高；當溫度超過55 ℃時，纖維素酶變性失活，從而使總黃酮提取率降低。

2.2 提取時間對總黃酮提取率的影響

提取溫度為55 ℃，纖維素酶用量為3 mg/g，料液比1∶40 (g/mL)，超聲功率為300 W，提取時間對總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 提取時間對總黃酮提取率的影響曲線

由圖2可知，隨著提取時間的延長，總黃酮提取率隨之升高，當提取時間達到2.0 h左右時，總黃酮提取率增加速度降低，這是因為長時間的超聲處理回事底物含量不斷降低，濃度差的推動力減弱，最后黃酮在溶劑中達到溶解平衡。

2.3 纖維素酶用量對總黃酮提取率的影響

提取溫度為55 ℃，提取時間為2.0 h，料液比為1∶40 (g/mL)，超聲功率為300 W，纖維素用量對冬棗葉中總黃酮提取率的影響見圖3。

由圖3可知，隨著纖維素酶用量的增加，總黃酮提取率隨之升高，當酶用量達到3 mg/g后，總黃酮提取率沒有明顯變化。說明纖維素酶用量為3 mg/g時，酶解效果基本達到最佳，再增加酶用量對總黃酮提取率沒有太大影響。

圖3 纖維素酶用量對總黃酮提取率的影響曲線

2.4 超聲功率對總黃酮提取率的影響

提取溫度為55 ℃，提取時間為2.0 h，纖維素酶用量為3 mg/g，料液比為1∶40 (g/mL)，超聲功率對冬棗葉中總黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對總黃酮提取率的影響曲線

由圖4可知，隨著超聲功率的增加，黃酮提取率顯著升高，當超聲功率達到350 W左右時，黃酮提取率開始下降。這是因為超聲功率越大，空化作用和機械作用越強，分子擴散速度越大，黃酮的溶出量就越多；但當超聲功率超過350 W后，由于功率過大，超聲時瞬間熱效應(yīng)過于明顯，使局部溫度過高而導(dǎo)致酶變性，從而影響黃酮的溶出，導(dǎo)致總黃酮提取率降低。

2.5 料液比對總黃酮提取率的影響

圖5 料液比對總黃酮提取率的影響曲線

提取溫度為55 ℃，提取時間為2 h，纖維素酶用量為3 mg/g，超聲功率為350 W，料液比對冬棗葉中的總黃酮提取率的影響見圖5。

由圖5可知，隨著料液比的增大，總黃酮提取率也隨之增大，當料液比超過1:50 (g/mL)，提取率有略微下降。這是因為在冬棗葉質(zhì)量一定的情況下，增加溶劑的量可以降低原料顆粒周圍的濃度，增大細胞壁內(nèi)外兩側(cè)的濃度差，從而促使有效成分的溶出；但溶劑量增加到一定程度后反而會降低超聲的作用，而使總黃酮提取率降低。

2.6 正交實驗

在單因素實驗優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取提取溫度(A)、提取時間(B)、纖維素酶用量(C)、超聲功率(D)4因素，設(shè)計L9(34)正交實驗。因素水平設(shè)計見表1，實驗結(jié)果見表2。

表1 正交因素水平表

表2 正交實驗結(jié)果表

由表2可知，各因素對總黃酮提取率的影響程度依次為：C>A>D>B，即纖維素酶用量>提取溫度>超聲功率>提取時間。提取總黃酮的最優(yōu)組合為A3B2C2D2，即提取溫度為60 ℃，提取時間為2.0 h，纖維素酶用量為3 mg/g，超聲功率為350 W。

按最佳提取條件重復(fù)實驗3次，進行驗證實驗，結(jié)果見表3，平均提取率為4.62%。

表3 驗證實驗數(shù)據(jù)表

2.7 對比實驗

表4 提取工藝對總黃酮提取率的影響

分別采用酶解法(提取溫度55 ℃，提取時間1.5 h，料液比1∶50 (g/mL)，纖維素酶用量4 mg/g)和超聲波輔助酶解法(提取溫度60 ℃，提取時間2.0 h，纖維素酶用量3 mg/g，料液比1∶50 (g/mL)，超聲功率350 W)提取冬棗葉總黃酮，結(jié)果見表4。

由表4可知，酶解法的提取率為2.48%，超聲波輔助酶解法的提取率為4.62%。可見相對于酶解法而言，超聲波輔助法可提高冬棗葉中總黃酮的提取率。

3 結(jié)論

超聲波輔助酶解法提取冬棗葉中總黃酮的最佳提取條件為：提取時間為2.0 h，提取溫度為60 ℃，纖維素酶用量為3 mg/g，超聲功率為350 W，料液比為1∶50 (g/mL)；在該條件下，冬棗葉總黃酮提取率為4.62%。與酶解法相比，超聲波輔助酶解法可提高冬棗葉中的總黃酮提取率，為冬棗葉的應(yīng)用研究提過了新方法。