李艷

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018）

黑皮雞樅菌（Termitomyces spp.）屬于擔(dān)子菌綱，傘菌目，側(cè)耳科，雞樅菌屬，是珍貴的野生食用菌，全世界約有25種，我國(guó)有19種，主要生長(zhǎng)在云南、四川、貴州等地[1]。自然界中雞樅菌只能生長(zhǎng)在白蟻巢穴上，白蟻菌圃中含有豐富的氨基酸等營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)[2-3]，與白蟻共生的野生雞樅菌同樣營(yíng)養(yǎng)豐富，尤其蛋白質(zhì)的含量較高，蛋白質(zhì)中含有豐富的氨基酸，其中人體必需的8種氨基酸種類齊全[4-5]。同時(shí)，與白蟻的復(fù)雜共生關(guān)系使人工栽培的雞樅菌與野生雞樅菌存在或多或少的差異。近年，雞樅菌的人工栽培技術(shù)趨于成熟，研究人工栽培雞樅菌中氨基酸的組成對(duì)于評(píng)價(jià)人工栽培雞樅菌技術(shù)具有重要的指導(dǎo)意義。

氨基酸是雞樅菌中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，目前對(duì)食用菌中氨基酸的測(cè)定主要通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行酸水解處理，再通過(guò)氨基酸分析儀檢測(cè)[1-2，6]。在酸性水解中，HCl是最通用的水解劑，但是酸水解過(guò)程中會(huì)不同程度的破壞半胱氨酸、絲氨酸和酪氨酸，并完全破壞色氨酸[7-8]。氨基酸分析儀檢測(cè)存在成本高，專屬性強(qiáng)，普及率低等問(wèn)題對(duì)實(shí)際操作造成諸多不便[9-10]。本研究通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化酸水解條件[11]，結(jié)合堿水解[12]和過(guò)甲酸氧化法[9]，對(duì)河北省靈壽縣和北京地區(qū)栽培的黑皮雞樅菌進(jìn)行水解處理，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定和分析兩個(gè)地區(qū)產(chǎn)黑皮雞樅菌中不同部位的氨基酸組成，為黑皮雞樅菌選擇性進(jìn)行深加工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

新鮮黑皮雞樅菌（Termitomyces spp.）：分別由河北靈濟(jì)食用菌有限公司和北京金珠滿江農(nóng)業(yè)有限公司提供。將雞樅菌子實(shí)體的菌傘、菌柄分離后分別切成細(xì)絲狀，置于鼓風(fēng)干燥箱中55℃干燥至恒重，粉碎，過(guò)40目篩，備用。

天門冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、羥基脯氨酸（Hyp）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、絲氨酸（Ser）、精氨酸（Arg）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、胱氨酸（Cys-S）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）、賴氨酸（Lys）和酪氨酸（Tyr）：美國(guó) sigma公司，純度均≥98%；色譜級(jí)甲醇和乙腈：湖北杜文化工科技有限公司；2，4-二硝基氟苯：艾科化學(xué)試劑公司；磷酸二氫鉀、無(wú)水乙酸鈉、冰乙酸、三乙胺、硼砂、硼酸、氫氧化鈉均為分析純；試驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

1.2 儀器

DWF-100型電動(dòng)植物粉碎機(jī)：河北省黃驊縣科研機(jī)械廠；101-0AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；Waters 2695高效液相色譜儀配有Wa ters 2695分離單元，2996型二極管陣列檢測(cè)器：沃特斯科技（上海）有限公司；Hypersil ODS2色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：大連依利特分析儀器有限公司。

2 方法

2.1 主要溶液的配制

pH 9.0硼酸緩沖溶液：配制0.05 mol/L的硼砂溶液和0.2 mol/L的硼酸溶液，按照體積比4∶1混合均勻。

pH 7.0磷酸緩沖溶液：稱取1.7 g磷酸二氫鉀固體，加水溶解，轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中，加入72.75 mL的0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液，定容后搖勻。

衍生試劑的配制：準(zhǔn)確量取0.5 mL的2，4-二硝基氟苯，用乙腈定容至50 mL。

氨基酸標(biāo)品的制備：稱取0.05 g氨基酸標(biāo)品用pH 9.0硼酸緩沖溶液定容至10 mL，得到5 mg/mL氨基酸標(biāo)品母液。取氨基酸標(biāo)品母液各0.5 mL于25 mL容量瓶中，用pH 9.0硼酸緩沖溶液定容，得到100 μg/mL氨基酸對(duì)照品混標(biāo)溶液。

過(guò)甲酸溶液：將30%的過(guò)氧化氫與88%甲酸按照體積比1∶9均勻混合，于室溫下放置1 h后置于冰水浴中冷卻30 min，用時(shí)現(xiàn)配。

2.2 樣品處理

對(duì)于不同種類的氨基酸，試驗(yàn)中采用3種水解方法對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，其中酸水解法適用于大部分氨基酸的水解，堿水解法適用于色氨酸分析，而過(guò)甲酸氧化法則適用于胱氨酸測(cè)定。

2.2.1 酸水解法

參考GB/T 5009.124-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》中樣品的處理方法，在以HCl濃度（mol/L）、HCl加入量（mL）、水解溫度（℃）、水解時(shí)間（h）為影響因素的最佳單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)。因素水平表見(jiàn)表1。

表1 酸水解正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Table of acid hydrolysis orthogonal test factor level

2.2.2 堿水解法

精確稱取黑皮雞樅菌粉25 mg（精確到0.000 1 g），置于10 mL水解管內(nèi)，加入5 mol/L NaOH溶液6 mL，氮吹儀吹氮?dú)?5 min后迅速封管；放入烘箱中110℃水解24 h；將水解后樣品從水解管中轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中，并用水多次洗滌水解瓶，洗液一并轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿，80℃水浴蒸干；用pH 9.0硼酸緩沖溶液分別多次洗滌蒸發(fā)皿，洗液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，pH 9.0硼酸緩沖溶液定容；用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.2.3 過(guò)甲酸氧化法

過(guò)甲酸氧化法借鑒于淑新等在高效液相色譜-柱前衍生化法測(cè)定飼料中的含硫氨基酸中應(yīng)用的方法[9]。

2.3 氨基酸柱前衍生法

采用2，4-二硝基氟苯為柱前衍生試劑。取0.5 mL氨基酸混標(biāo)溶液至5 mL棕色容量瓶中，分別加入NaHCO3緩沖溶液和2，4-二硝基氟苯各0.5 mL，放入60℃水浴中，暗處反應(yīng)60 min。取出后避光冷卻至室溫，用pH 7.0磷酸緩沖溶液定容至5.0 mL，靜置15 min，取 10 μL 進(jìn)樣分析[13]。

2.4 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2色譜柱250 mm×4.6 mm，5μm；流動(dòng)相A：稱取3.56g無(wú)水乙酸鈉，溶于1 000 mL水中，加入0.1%三乙胺，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 6.4。流動(dòng)相 B：50%乙腈水；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：23 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；梯度洗脫程序：0～20 min，30%～36%B；20 min～26 min，36%～55%B；26 min～41 min，55%～65%；41 min～46 min，65%～90%B；46 min～48 min，90%～98%B；48 min～54 min，98%～30%B[13]。

2.5 數(shù)據(jù)處理

色譜分析采用儀器自帶Waters-Empower軟件。所有線性方程、重復(fù)性和準(zhǔn)確性試驗(yàn)數(shù)據(jù)均由Excel 2010計(jì)算得出。正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Minitab 15進(jìn)行方差分析。所有試驗(yàn)進(jìn)行3組平行。

3 結(jié)果與分析

3.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取氨基酸對(duì)照品混標(biāo)溶液，配制成10、20、50、80、100μg/mL的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液，各水平進(jìn)行3次重復(fù)，以峰面積為縱坐標(biāo)，以氨基酸濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，R2均大于0.999，氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見(jiàn)表2。

表2 氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 2 The standard curve equation of amino acids

3.2 酸水解優(yōu)化結(jié)果

按照2.2.1中的方法進(jìn)行試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析分別見(jiàn)表3和表4。

表3 黑皮雞樅菌酸水解正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of acid hydrolysis orthogonal test in Termitomyces spp.

續(xù)表3 黑皮雞樅菌酸水解正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 3 Results of acid hydrolysis orthogonal test in Termitomyces spp.

表4 黑皮雞樅菌酸水解正交試驗(yàn)方差分析表Table 4 Table of the variance analysis for acid hydrolysis orthogonal experimental in Termitomyces spp.

由表3和表4可看出，所篩選的4個(gè)試驗(yàn)條件對(duì)結(jié)果的影響因素大小為HCl濃度＞HCl加入量＞水解溫度＞水解時(shí)間。其中HCl濃度和HCl加入量對(duì)于結(jié)果有極顯著影響，水解溫度、水解時(shí)間對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著。正交試驗(yàn)中最優(yōu)組合為A2B2C2D2。正交試驗(yàn)中第5組，即HCl濃度為6mol/L、HCl加量為4 mL、水解溫度120℃、水解時(shí)間20 h時(shí)測(cè)得的氨基酸總量最高，為20.1%。但是，第5組并不是最優(yōu)組合的結(jié)果，按照正交試驗(yàn)中的最優(yōu)組合，即HCl濃度為6 mol/L、HCl加量為4 mL、水解溫度110℃、水解時(shí)間24 h為條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)[14]，水解后氨基酸總量達(dá)20.5%，因此確定為試驗(yàn)的最優(yōu)條件，后續(xù)對(duì)不同批次黑皮雞樅菌中的氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)均采用該條件。

3.3 黑皮雞樅菌中氨基酸含量的測(cè)定

以優(yōu)化后的酸水解方案配合堿水解和過(guò)甲酸氧化法，對(duì)河北省靈壽縣和北京兩個(gè)產(chǎn)地栽培的黑皮雞樅菌中的氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，樣品分為子實(shí)體、菌傘和菌柄，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同地區(qū)黑皮雞樅菌菌柄、菌傘和子實(shí)體中氨基酸含量及組成Table 5 The content and composition of amino acids in pileus，stipe and sporophore of Termitomyces spp.in two different area

由表5可以看出，在兩個(gè)地區(qū)所栽培的黑皮雞樅菌中均檢測(cè)出除甘氨酸外21種氨基酸，鄒立扣[1]和施渺筱[6]分別對(duì)四川省和貴州省野生雞樅菌進(jìn)行氨基酸測(cè)定，均含有甘氨酸，這可能是人工栽培黑皮雞樅菌與野生雞樅菌存在的差異性。靈壽縣栽培的黑皮雞樅菌氨基酸總量稍低于北京地區(qū)產(chǎn)品，分別為21.51%和23.68%，說(shuō)明存在地域差異。黑皮雞樅菌的不同部位氨基酸含量也存在差異，菌傘中的氨基酸含量方差分析表幾乎均高于菌柄，且菌傘中氨基酸總量均高出1.27倍左右，這與其他研究雞樅菌氨基酸測(cè)定的結(jié)果相一致[1，11]。本試驗(yàn)測(cè)定的完整菌子實(shí)體指的是不將菌傘、菌柄分離，直接切成絲狀、干燥、粉碎、過(guò)篩的樣品，所測(cè)定各種氨基酸含量應(yīng)在菌傘、菌柄之間，但是表5中，菌子實(shí)體的賴氨酸、色氨酸、組氨酸等幾個(gè)氨基酸的含量略有偏差，但是均比較接近，這可能是由于樣品處理過(guò)程中的試驗(yàn)誤差造成的。

續(xù)表5 不同地區(qū)黑皮雞樅菌菌柄、菌傘和子實(shí)體中氨基酸含量及組成Continue table 5 The content and composition of amino acids in pileus，stipe and sporophore of Termitomyces spp.in two different area

靈壽縣和北京市栽培黑皮雞樅菌中均檢測(cè)到的21種氨基酸中，包含8種人體必需氨基酸、1種嬰兒必需氨基酸和3種鮮味氨基酸。8種人體必需氨基酸的總量分別為7.77%和9.01%，分別占氨基酸總量的36.12%和38.05%；組氨酸是嬰兒必需氨基酸，其含量分別為4.54%和5.06%，達(dá)到氨基酸總量的21.11%和21.37%；3種鮮味氨基酸指谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸，它們的總量分別為5.19%和5.22%，分別占氨基酸總量的24.13%和22.04%。相對(duì)于已有報(bào)道的食用菌中氨基酸含量的檢測(cè)結(jié)果，無(wú)論從氨基酸種類還是含量上來(lái)說(shuō)，黑皮雞樅菌都是一種具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的高氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的食用菌[15-16]。Kwang Jae Lee等[17]測(cè)定了茶樹(shù)菇及其他食用菌中的氨基酸組成與含量，由于只采用了酸水解法對(duì)樣品進(jìn)行處理，均未檢測(cè)到色氨酸和胱氨酸，并且所測(cè)定食用菌中必需氨基酸的總量均小于3%，氨基酸總量均小于6%；高燕紅等[18]對(duì)6種食用菌中氨基酸與蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析，其中姬松茸中的氨基酸總量最高，達(dá)到25.07%，其次為冬菇，氨基酸總量為15.96%，云耳、銀耳等其他4種食用菌的氨基酸總量均在10%以下，遠(yuǎn)低于本試驗(yàn)所測(cè)黑皮雞樅菌中氨基酸的總量，這充分說(shuō)明這兩個(gè)地區(qū)人工栽培的黑皮雞樅菌氨基酸種類和含量豐富，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。

靈壽縣和北京市人工栽培的黑皮雞樅菌中粗蛋白含量分別是35.33%和42.13%，氨基酸總量分別占其粗蛋白含量的60.88%和56.21%，必需氨基酸與總氨基酸比值（essential amino acid/total amino acid，EAA/TAA）分別為36.12%、38.05%，必需氨基酸與非必需氨基酸比值（essential amino acid/nonessential amino acid，EAA/NEAA）分別為56%和61%，與聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）/世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦的理想蛋白質(zhì)模式EAA/TAA為40%和EAA/NEAA為0.6接近[19]。因此，黑皮雞樅菌中氨基酸的模式與人體所需氨基酸模式相似，是一種適合人體吸收的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來(lái)源。所測(cè)黑皮雞樅菌中含量較高的氨基酸是組氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和天冬氨酸，組氨酸在嬰兒體內(nèi)不能自己合成，是嬰兒必需氨基酸，苯丙氨酸和賴氨酸屬于人體所需8種必需氨基酸，谷氨酸和天冬氨酸是對(duì)鮮味有影響的特征氨基酸。由此可以看出，黑皮雞樅菌具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和開(kāi)發(fā)價(jià)值。

本研究采用了3種水解法檢測(cè)黑皮雞樅菌中的氨基酸，共檢測(cè)出21種氨基酸，目前研究中對(duì)雞樅菌氨基酸的檢測(cè)主要集中在以酸水解為主，用氨基酸分析儀檢測(cè)，酸水解并不能夠全面檢測(cè)出氨基酸的種類。如施渺筱等[4]在黔產(chǎn)雞樅菌中檢測(cè)出的氨基酸16種；張靈芝等[19]在云南產(chǎn)雞樅菌中檢測(cè)出17種氨基酸；鄒立扣等[1]在四川省生長(zhǎng)的10種雞樅菌中檢測(cè)出17種氨基酸。因此，本試驗(yàn)所建立的雞樅菌水解處理的方法是可行可靠的。

4 結(jié)論

研究采用了酸水解法、堿水解法和過(guò)甲酸氧化法分別對(duì)靈壽縣和北京市栽培的新鮮黑皮雞樅菌進(jìn)行3種方法水解，并對(duì)酸水解條件進(jìn)行正交試優(yōu)化，結(jié)果顯示在HCl濃度為6 mol/L、HCl加入量為4 mL、水解溫度110℃、水解時(shí)間24 h為水解條件時(shí)，能夠獲得較高的氨基酸含量。對(duì)3種方法水解后的水解液以2，4-二硝基氟苯作為柱前衍生劑進(jìn)行HPLC法檢測(cè)，共測(cè)出21種氨基酸，北京市所產(chǎn)黑皮雞樅菌氨基酸含量稍高于靈壽縣，菌傘中氨基酸含量高于菌柄中。黑皮雞樅菌氨基酸EAA/TAA、EAA/NEAA表明其蛋白質(zhì)屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。通過(guò)3種水解方法結(jié)合處理樣品可以更全面的檢測(cè)雞樅菌中的氨基酸，為后續(xù)對(duì)雞樅菌乃至其他食用菌類氨基酸的研究提供了理論支撐。對(duì)子實(shí)體、菌傘和菌柄分別測(cè)定對(duì)于后續(xù)有選擇性的進(jìn)行深加工產(chǎn)品開(kāi)發(fā)具有指導(dǎo)意義。