楊 成 李 晶 徐 悅 郭露露 沈曉芳*

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122）

肉類真實(shí)性鑒別是經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)型慘假（Economically Motivated Adulteration，EMA） 研究的主要內(nèi)容之一。例如，自2013年歐洲“馬肉丑聞”事件、中國(guó)“假羊肉”事件后，經(jīng)濟(jì)日?qǐng)?bào)等媒體相繼曝光了河間多個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)黑作坊將騾子肉、馬肉、豬肉加工后冒充驢肉出售。然而，僅依靠視覺、嗅覺、觸覺等感官手段鑒別肉的真?zhèn)?，具有主觀差異性、可靠性和科學(xué)性不高。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，研究者開始從分子水平對(duì)動(dòng)物性成分進(jìn)行鑒定。目前，對(duì)肉類成分的生物性鑒別方法主要包括基于蛋白的檢測(cè)方法，如免疫學(xué)方法、酶聯(lián)免疫法和生物質(zhì)譜技術(shù)等；以及基于核酸的方法，主要包括利用PCR等技術(shù)對(duì)肉源性成分鑒別的方法。DNA檢測(cè)法可為利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)肉制品的種源、摻假性檢測(cè)提供幫助。DNA檢測(cè)的關(guān)鍵在于快速、簡(jiǎn)潔提取DNA。目前，動(dòng)物源DNA的提取方法較少，主要有SDS法、CTAB法、異硫氰酸胍法、試劑盒法等。本文利用SDS法、CTAB法、改良氯化鈉法和試劑盒法對(duì)豬肉、牛肉、羊肉中DNA進(jìn)行提取，并對(duì)提取結(jié)果進(jìn)行比較，為后續(xù)利用分子生物學(xué)技術(shù)開展深加工肉制品中動(dòng)物源成分鑒別工作提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品材料

新鮮豬肉、牛肉、羊肉，采購(gòu)于某大型超市。

1.1.2 試劑

SDS裂解液；醋酸鉀溶液；NaCl；氯仿-異戊醇，體積比24∶1；無(wú)水乙醇；TE緩沖液；CTAB裂解液，源葉生物技術(shù)有限公司；Tris-飽和酚，源葉生物技術(shù)有限公司；β-巰基乙醇；EDTA；異丙醇，阿拉?。坏鞍酌窴，質(zhì)量濃度20mg/mL，阿拉丁；DNA提取試劑盒，Tiangen。

1.2 儀器與設(shè)備

渦旋混勻器，IKA VORTEX2；Centrifuge5810R型臺(tái)式離心機(jī)，eppendorf；UV－3600 Plus型紫外可見分光光度計(jì)，SHIMADZU；T18 digital均質(zhì)機(jī)，IKA。

1.3 DNA提取方法

1.3.1 樣品前處理

稱取10 g樣品，加入4mLTE緩沖液混合后，在均質(zhì)機(jī)中粉碎勻漿，-20℃保存，備用。

1.3.2 SDS法

參考高丹丹，陳燕等的研究，并進(jìn)行適當(dāng)修改。取0.5 g樣品于15mL離心管中，加入7mL裂解液，并加入40μL 20mg/mL蛋白酶K；65℃下消化3 h～5 h至無(wú)明顯組織塊；加入700μL醋酸鉀溶液，混勻，冰浴15min后，12 000 r/min、4℃、離心10min；取上清至新離心管中，加入等體積Tris-飽和酚，充分混勻，靜置10min后，12 000 r/min、4℃、離心10min；取上清液至新離心管中，加0.5倍體積氯仿-異戊醇（體積比24∶1），充分混合后，12 000 r/min、4℃、離心10 min；重復(fù)上述步驟至兩相中間無(wú)明顯的變性蛋白質(zhì)為止。將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入兩倍體積-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，輕輕搖晃至有絮狀沉淀析出，12 000 r/min離心10min，棄去上清液；加入600μL體積濃度70%乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min離心3 min，棄去上清液，重復(fù)上述步驟1～2次后，室溫下靜置使乙醇完全揮發(fā)；將DNA沉淀溶解于500μLTE緩沖溶液中，-20℃保存。

1.3.3 改良氯化鈉法

參考 Burhanettin Yal?1nkaya.etal，并進(jìn)行適當(dāng)修改。取0.5 g樣品于15mL離心管中，加入1mL TE緩沖液，8mL lysis緩沖液和0.8mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的SDS，置于渦旋混勻器上混合均勻；加入40μL 20mg/mL的蛋白酶K，混勻后65℃水浴1 h，加入6mL 5mol/L的NaCl溶液，于渦旋混勻器上混勻30 s，10 000 r/min離心30min，然后將其上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻后，16 000 r/min離心20min，棄去上清液，將DNA沉淀溶解于1 mL TE緩沖溶液中，-20℃保存。

1.3.4 CTAB法

參考GB/T 21101-2005，并進(jìn)行適當(dāng)修改。取0.5 g樣品于15 mL離心管中，12 000 r/min離心1min，棄去上清液，加入7mLCTAB裂解液和50μL β-巰基乙醇，60℃水浴30min；10 000 r/min離心15min，吸取上清液至新離心管中，加等體積的氯仿-異戊醇（體積比24∶1），12 000 r/min離心5min；重復(fù)上述步驟至兩相中間無(wú)明顯變性蛋白質(zhì)出現(xiàn)。取上清液至新離心管中，加2.5倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后冰浴20 min；12 000 r/min離心15 min，棄去上清液；體積濃度70%乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min離心5min，棄上清，室溫晾干；將DNA沉淀溶解于500μLTE緩沖溶液中，-20℃保存。

1.3.5 試劑盒提取法

按照試劑盒說明書操作進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種方法提取樣品DNA的濃度與純度

用紫外分光光度法鑒定DNA的濃度與純度：取10μL的DNA提取液稀釋300倍，依次測(cè)定試驗(yàn)樣品在230 nm、260 nm、280 nm波長(zhǎng)下的吸光值，通過OD260/280計(jì)算各樣品中的DNA純度并計(jì)算DNA的濃度。DNA濃度計(jì)算公式如下：

DNA質(zhì)量濃度（μg/mL）=50μg/mL×OD260×稀釋數(shù)倍

OD260/280值在1.8以下表示有蛋白質(zhì)污染，在2.0以上表示有RNA污染，在1.8左右表示DNA純度較高。OD260/230在2.0以下表示可能有碳水化合物如糖類、鹽類或有機(jī)溶劑等小分子污染物，若OD260/230高于2.0則說明無(wú)明顯小分子污染。

2.1.1 4種方法提取樣品DNA的純度比較

4種方法提取樣品DNA的純度比較如下頁(yè)圖1。

由圖1可知，對(duì)于牛肉、羊肉和豬肉，采用SDS法提取得到的DNA純度相對(duì)于其他3種方法均相對(duì)較高，改良氯化鈉法次之，CTAB法最差。使用SDS法時(shí)3種樣品的OD260/280均在1.8-2.0范圍內(nèi)，且OD260/230均大于2.0；使用改良氯化鈉法時(shí)3種樣品的OD260/280均在1.8-2.0范圍內(nèi)，但從OD260/230來(lái)看，除羊肉外，另外兩種樣品受小分子物質(zhì)污染略微嚴(yán)重；采用試劑盒法和CTAB法時(shí)所提DNA受蛋白質(zhì)和RNA的影響均不大，但小分子物質(zhì)的污染較嚴(yán)重。綜上所述，用SDS法和改良氯化鈉法提取的基因組DNA純度均較高。

2.1.2 4種方法提取樣品DNA的濃度比較

4種方法提取樣品DNA的濃度比較如圖2。

圖1 改良氯化鈉法、試劑盒法、SDS法和CTAB法提取牛肉、羊肉和豬肉DNA純度的比較

圖2 改良氯化鈉法、試劑盒法、SDS法和CTAB法提取牛肉、羊肉和豬肉DNA濃度的比較

由圖2可知，改良氯化鈉法提取得到的DNA濃度明顯高于其他方法，SDS法次之，CTAB法效果最差。這主要是由于SDS（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去污劑，其可溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)，且SDS可與小分子物質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，EDTA可抑制DNA酶的活性，再加入氯化鈉后，高濃度的鹽可使蛋白質(zhì)變性沉淀而析出，因此DNA得率較高。

2.1.3 4種提取方法所用時(shí)間

4種提取方法所用時(shí)間見表1。

表1 4種方法所用時(shí)間 min

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

圖3為采用4種方法對(duì)牛肉的基因組DNA完整性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。其中，1～3為CTAB法；4～6為試劑盒法；7～9為 SDS法；10～12為改良氯化鈉法。

圖3 4種方法和CTAB法提取牛肉DNA的瓊脂凝膠檢測(cè)結(jié)果圖

由圖3可以得出，4種方法提取到的DNA都呈明亮均一的條帶，泳道較為干凈，沒有拖尾現(xiàn)象，即均未發(fā)生降解，表明提取得到的基因組DNA完整性良好，且改良氯化鈉法、SDS法提取的牛肉制品的基因組DNA條帶更為清晰明亮，更完整。

3 結(jié)論

通過對(duì)4種方法提取得到DNA的純度、濃度以及所用時(shí)間進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)對(duì)于豬肉、牛肉、羊肉這3種樣品，不同提取方法得到的DNA濃度、純度均存在比較明顯的差異。采用改良氯化鈉法和SDS法提取得到的DNA純度均相對(duì)較高，但相比于改良氯化鈉法，SDS法用時(shí)長(zhǎng)；試劑盒法操作簡(jiǎn)單，但提取得到的濃度相對(duì)較低，且易受小分子物質(zhì)的污染；CTAB法用時(shí)最短，但提取得到的DNA濃度和純度均低于其他3種方法。