楊學(xué)民，李朝路，李兆陽(yáng)

本研究通過構(gòu)建microRNA194過表達(dá)的肝癌細(xì)胞，在體外細(xì)胞學(xué)和動(dòng)物體內(nèi)觀察了microRNA194對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響，同時(shí)初步探討了microRNA194發(fā)揮作用的下游靶基因情況。

1 材料與方法

1.1 肝癌細(xì)胞Hep3B培養(yǎng) Hep3B細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，使用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司）培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（融合度為70%～80%）時(shí)，行細(xì)胞傳代和轉(zhuǎn)染等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 microRNA194模擬物的合成 合成microRNA194模擬物（microRNA194 mimics）和陰性對(duì)照（control）序列，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成（表1）。

表1 microRNA194模擬物和陰性對(duì)照序列

1.3 過表達(dá)microRNA194肝癌細(xì)胞Hep3B構(gòu)建按照LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染液（Invitrogen公司）說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，具體步驟，1，細(xì)胞準(zhǔn)備：轉(zhuǎn)染前24 h，將合適數(shù)量的Hep3B細(xì)胞接種于96孔板，加入用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基100 μl/孔培養(yǎng)，使細(xì)胞融合度達(dá)到50%～70%；2，轉(zhuǎn)染液的配制：A液：每孔microRNA194模擬物和陰性對(duì)照各4 pmol，溶于不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司）25 μl；B 液：每孔 0.2 μl的LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染液溶于不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基25 μl，靜置5 min。將A液與B液混勻，每孔共50 μl，靜置20 min，以利于充分形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；3，吸棄96孔板上清培養(yǎng)液，PBS洗滌，每孔加入不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基50 μl，隨后加入第2步中配制的轉(zhuǎn)染液（50 μl/孔），將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。然后，將培養(yǎng)上清液吸棄，加入新鮮配置的含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；4，采用熒光定量PCR法檢測(cè)microRNA194 mRNA水平，驗(yàn)證是否成功構(gòu)建過表達(dá)microRNA194的肝癌細(xì)胞Hep3B，檢測(cè)microRNA194的引物序列見表2，由上海生工生物工程有限公司合成。

表2 熒光定量PCR反應(yīng)引物序列

1.4 過表達(dá)microRNA194荷瘤小鼠的構(gòu)建 取30只健康清潔級(jí)Balb/c裸鼠（4周齡，15～20 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分配為microRNA194過表達(dá)組15只和對(duì)照組15只。使用1%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，使用75%酒精對(duì)腋下皮膚進(jìn)行局部消毒，使用1 ml注射器吸取Hep3B細(xì)胞懸液200 μl（2×106）皮下接種，分別使用microRNA194模擬物轉(zhuǎn)染的Hep3B細(xì)胞或用陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染的Hep3B細(xì)胞。

1.5 腫瘤體積和質(zhì)量監(jiān)測(cè) 在接種Hep3B細(xì)胞后，每隔5 d，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)和寬，按照公式（體積=0.52×長(zhǎng)×寬2）計(jì)算腫瘤體積。在接種細(xì)胞后21 d，將Balb/c裸鼠處死，小心分離腫瘤，稱質(zhì)量后將腫瘤組織保存于-80℃。

1.6 腫瘤組織microRNA194和IGF1R mRNA水平檢測(cè) 采用熒光定量PCR法檢測(cè)，microRNA194和胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF1R）mRNA的引物序列參照文獻(xiàn)進(jìn)行合成[1]（表2，上海生工生物工程有限公司）。依次進(jìn)行組織mRNA提取、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA和熒光定量PCR檢測(cè)，將對(duì)照組microRNA194和IGF1R mRNA水平設(shè)定為 1，與microRNA194過表達(dá)組進(jìn)行比較。

1.7 腫瘤組織IGF1R蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法，使用抗IGF1R抗體和抗內(nèi)參GAPDH蛋白抗體（Abcam公司）檢測(cè)，使用Image Pro Plus 6.0軟件分析IGF1R蛋白與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶的灰度值，IGF1R蛋白與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值即為IGF1R蛋白的相對(duì)含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0軟件行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)，代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以*表示；當(dāng)P＜0.01時(shí)，代表具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以**表示。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞microRNA194 mRNA水平比較 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染microRNA194模擬物的過表達(dá)組與對(duì)照組相比，microRNA194 mRNA水平顯著升高（P＜0.01，圖1），表明我們成功構(gòu)建了過表達(dá)microRNA194的肝癌細(xì)胞。

圖1 兩組細(xì)胞microRNA194 mRNA水平比較

2.2 兩組荷瘤小鼠肝癌組織microRNA194 mRNA水平比較 結(jié)果顯示，microRNA194過表達(dá)腫瘤microRNA194 mRNA水平比對(duì)照組顯著升高（P＜0.01，圖2），表明我們成功構(gòu)建了過表達(dá)microRNA194的荷瘤小鼠。

圖2 兩組小鼠肝癌組織microRNA194 mRNA水平比較

2.3 兩組小鼠腫瘤體積和質(zhì)量比較 結(jié)果顯示，在接種細(xì)胞后第6 d開始，microRNA194過表達(dá)組腫瘤體積顯著小于對(duì)照組（P＜0.05），并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，差異逐漸變得更顯著（P＜0.01，圖3），兩組小鼠腫瘤質(zhì)量有類似的變化（資料未列出），表明過表達(dá)microRNA194可以抑制肝腫瘤生長(zhǎng)。

圖3 兩組小鼠肝癌體積比較

2.4 高表達(dá)的microRNA194降低腫瘤組織IGF1R mRNA水平并抑制其蛋白表達(dá) microRNA194過表達(dá)組IGF1R mRNA水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.01，圖4），IGF1R蛋白表達(dá)量也顯著降低（圖5），表明高表達(dá)的microRNA194可以抑制IGF1R的表達(dá)，可能為其抑制肝腫瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制之一。

圖4 兩組小鼠肝癌組織IGF1R mRNA水平比較

圖5 兩組小鼠肝癌組織IGF1R蛋白表達(dá)的比較

3 討論

有人通過對(duì)17例不同病因?qū)е碌母伟┗颊?5個(gè)臨床樣本進(jìn)行microRNA高通量分析，發(fā)現(xiàn)一系列microRNA在肝癌的早期階段就發(fā)生了差異性表達(dá)，并參與隨后的肝癌進(jìn)展[1-5]，這些microRNA包括miR-21-5pmiR-375、miR-200a-3p、miR-200b-3pmiR-141-3p、miR-429、miR-16-5p 等[6-9]。

microRNA194也被發(fā)現(xiàn)在肝臟疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，包括肝纖維化、乙型肝炎發(fā)病等[6，20]。研究報(bào)道m(xù)icroRNA194和microRNA150水平在肝纖維化大鼠模型的肝臟組織中顯著降低，它們的過表達(dá)可以抑制肝細(xì)胞增殖、表達(dá)平滑肌肌動(dòng)蛋白和Ⅰ型膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，從而在肝臟纖維化過程中發(fā)揮抑制作用[15-20]。但是，目前關(guān)于microRNA194在肝癌發(fā)病中的相關(guān)報(bào)道仍然較少，僅有少數(shù)幾篇報(bào)道，如有人發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的microRNA194可以降低N-cadherin的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞的遷移[14]。關(guān)于microRNA194抑制肝癌轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制，也有人發(fā)現(xiàn)可能與其抑制下游靶基因絲裂原激活蛋白激酶4(mitogen-activated protein kinase 4，MAPK4）的表達(dá)有關(guān)[6]。盡管如此，microRNA194對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡等其他生物學(xué)功能仍未闡明，而且具體的信號(hào)通路和下游靶基因復(fù)雜，仍有待更充分的挖掘。

本文研究了microRNA194過表達(dá)對(duì)肝癌組織生長(zhǎng)的影響，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建了過表達(dá)microRNA194的肝癌細(xì)胞Hep3B，并將其接種于Balb/c裸鼠皮下，采用熒光定量PCR法驗(yàn)證了荷瘤小鼠肝癌組織中microRNA194 mRNA呈高水平，因此我們成功構(gòu)建了microRNA194高水平的荷瘤小鼠模型。隨后，我們對(duì)腫瘤的體積和質(zhì)量進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的microRNA194可以顯著抑制肝腫瘤的生長(zhǎng)。

為了進(jìn)一步探討microRNA194的高表達(dá)抑制肝癌生長(zhǎng)的具體機(jī)制，我們對(duì)microRNA194下游靶基因的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。在研究microRNA194在骨肉瘤中的作用機(jī)制時(shí)，有人通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)、熒光定量PCR和Western blot等方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，microRNA194可能通過與IGF1R的3’端非編碼區(qū)結(jié)合，抑制IGF1R的表達(dá)，從而在骨肉瘤的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮抑制作用[15]。我們?cè)诒疚闹幸惭芯苛薽icroRNA194過表達(dá)對(duì)IGF1R表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)microRNA194過表達(dá)組與對(duì)照組相比，IGF1R mRNA水平顯著降低，表明高表達(dá)的microRNA194可以抑制IGF1R的表達(dá)，有可能參與了microRNA194高表達(dá)抑制肝腫瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制。