寧波御坊堂生物科技有限公司，浙江 寧波 315012

海狗丸是由海狗、枸杞子、益智、山藥、蠶蛹和肉桂六味藥物組成的復(fù)方制劑，具有抗疲勞的保健功效。海狗丸中的君藥為海狗，本實(shí)驗(yàn)所用海狗丸選用加拿大紐芬蘭養(yǎng)殖區(qū)海狗的海狗鞭入藥。海狗鞭具補(bǔ)腎固元、補(bǔ)血益氣、抗衰益壽等多種功效。

睪丸間質(zhì)細(xì)胞主要功能是合成、分泌睪酮[1]，是睪丸中分泌睪酮的主要細(xì)胞，而睪酮在精子發(fā)生中起重要作用，其分泌活動(dòng)主要由下丘腦、垂體及自身調(diào)節(jié)作用控制。睪丸間質(zhì)細(xì)胞的研究無(wú)論在男性的生殖健康，還是機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，以及內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)方面都具有重要的地位[2-3]。研究結(jié)果表明：腎陽(yáng)虛證患者通常存在腎上腺功能紊亂、甲狀腺功能紊亂、性腺功能紊亂、垂體功能紊亂等內(nèi)分泌失調(diào)現(xiàn)象[4-6]，故將腎陽(yáng)虛證定位在下丘腦-垂體-靶腺軸(腎上腺、甲狀腺、性腺)上。其中能夠反映下丘腦-垂體-性腺軸的功能異常的主要指標(biāo)包括血清睪丸酮(T)下降，雙氫睪酮(DHT)降低，血清雌二醇(E2)升高[7]；同時(shí)當(dāng)此性腺軸功能異常時(shí)，還會(huì)伴隨著睪丸、前列腺、精囊腺等器官出現(xiàn)組織學(xué)改變。研究采用MTT比色法和生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，考察海狗丸對(duì)大鼠的睪丸間質(zhì)細(xì)胞增值及睪酮(T)分泌的影響，從細(xì)胞水平上探索海狗丸的壯陽(yáng)生精活性，為海狗丸的藥效研究提供參考和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HERAEUSHERAcell 150 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；SW-CJ-1CU雙人單面超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；METTLER TOLEDO 電子天平(SARTORIUS AG)；細(xì)胞成像倒置顯微鏡(奧林巴斯公司)；Model 680型酶標(biāo)儀(日本TAKARA公司)。

1.2 藥物 海狗丸(批號(hào)：B17170001，寧波御坊堂生物科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物 Wistar大鼠，SPF級(jí)，雄性，11～12周齡，體重 260～280g，許可證號(hào)：SYXK(京)2017-0022。

1.4 試劑 胎牛血清、D-MEM / F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液均購(gòu)于Gibco公司；Ⅰ型膠原酶和MTT均購(gòu)于Sigma公司；人絨毛膜促性腺激素(HCG)購(gòu)于寧波第二激素廠；大鼠睪酮(T)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)試劑盒(ELISA)購(gòu)于RAD公司。

2 方法

2.1 藥物制備 將海狗丸樣品用剪刀剪碎，電子天平精密稱定0.001 g后置于1 mL容量瓶中，然后加入D-MEM /F12培養(yǎng)基溶解并定容，得到濃度為1 mg/mL的供試品溶液。再將上述供試品溶液用0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌，所得濾液待用且藥物制備在細(xì)胞給藥前配置。

2.2 睪丸間質(zhì)細(xì)胞懸浮液的制備 依據(jù)參考文獻(xiàn)[8-10]結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方法學(xué)研究和設(shè)計(jì)，主要研究確定了細(xì)胞離體培養(yǎng)的時(shí)間、細(xì)胞換液的時(shí)間和次數(shù)、細(xì)胞鋪板的密度、海狗丸的給藥濃度、給藥后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間等實(shí)驗(yàn)參數(shù)，對(duì)參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行改進(jìn)。將Wistar大鼠用10%水合氯醛麻醉，脫椎處死后用75%乙醇浸泡10 min，置于已滅菌處理的培養(yǎng)皿中，在無(wú)菌狀態(tài)下用眼科剪和鑷剪剖開(kāi)下腹，除去睪丸外層的附睪組織，取出一側(cè)完整的睪丸后，用預(yù)冷的PBS(0.01 mol/L，pH7.2)緩沖液進(jìn)行沖洗后除去白膜，置0.05% I型膠原酶(約用10 mL)中輕輕吹打數(shù)次，使組織分散，37 ℃震蕩水浴消化30 min。加入等體積含10%胎牛血清的D-MEM/F12培養(yǎng)液終止消化，然后用吸管吹打，使睪丸間質(zhì)細(xì)胞充分散開(kāi)。用4層紗布過(guò)濾，收集濾液，在1000 r/min條件下離心10 min，沉淀的細(xì)胞加入培養(yǎng)基吹打沖洗細(xì)胞中殘留的消化液，低速(1000 r/min) 離心10 min，棄上清。用含10%胎牛血清的D-MEM/F12培養(yǎng)基10 mL吹打成均勻的懸浮細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱條件下內(nèi)培養(yǎng)36 h，待睪丸間質(zhì)細(xì)胞貼壁，傾出培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗至瓶壁上沒(méi)有漂浮細(xì)胞，再加入培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d，此培養(yǎng)時(shí)間是由方法學(xué)考察后確定的。

定時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，選取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到鏡下觀察覆蓋80%～90%、細(xì)胞伸展成不規(guī)則形態(tài)時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化，至細(xì)胞縮成小圓形并呈現(xiàn)部分輕輕浮動(dòng)現(xiàn)象時(shí)，終止消化，棄去消化液。然后向其中加入5 mL培養(yǎng)基，用吸管吹下貼壁的Leydig細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞活度測(cè)定后，準(zhǔn)備鋪板。前期已對(duì)細(xì)胞鋪板密度進(jìn)行考察，將細(xì)胞鋪板密度定為105個(gè)/mL。用含有10%胎牛血清的D-MEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至105個(gè)/mL，取100 μL/孔的細(xì)胞懸浮液接種于96孔板(鋪板)，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d，給藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

其中在細(xì)胞活力檢測(cè)階段：截取時(shí)間點(diǎn)分別為4 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，分別給每孔加入20 μL MTT試液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，將液體倒出，每孔加入100 μL DMSO，置于酶標(biāo)儀震蕩10 min，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以吸光度OD值為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制睪丸間質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，如圖1所示。

由生長(zhǎng)曲線可知：細(xì)胞處于正常生長(zhǎng)狀態(tài)，在72 h左右，細(xì)胞處于穩(wěn)定的狀態(tài)，在24～72 h細(xì)胞基本處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

2.3 MTT法考察海狗丸對(duì)Leydig細(xì)胞的增殖作用

2.3.1 MTT的配制 稱取MTT0.25 g，溶于50 mL的磷酸緩沖液(PBS)，用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，取實(shí)驗(yàn)用量，放4 ℃避光保存?zhèn)溆?。其余在無(wú)菌條件下，分裝1.5 mL到2 mL EP管，置-20 ℃長(zhǎng)期保存。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟 將鋪板后的睪丸間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)2天后，棄去培養(yǎng)液，按實(shí)驗(yàn)分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行給藥處理。樣品組每組分別加入海狗丸供試品溶液100 μL/孔(濃度分別為50 μg/mL、100 g/mL、200 μg/mL)，每個(gè)樣品濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。空白對(duì)照組加入D-MEM/F12培養(yǎng)液100 μL/孔，設(shè)5個(gè)復(fù)孔。陽(yáng)性組加入含人絨毛膜促性腺激素(HCG)的D-MEM/F12培養(yǎng)液(含HCG終濃度為1 U/mL)100 μL/孔，設(shè)5個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、含5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后向每孔加入5 mg/mL的 MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h。取出培養(yǎng)板，將96孔培養(yǎng)板傾斜約30度角，小心吸去上清液后將每孔加入100 μL的DMSO，并立刻轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)儀中在37 ℃振蕩10 min后測(cè)定490 nm下的OD值[11]。

按公式計(jì)算睪丸間質(zhì)細(xì)胞增值率：

細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值)/ 空白孔OD值× 100%

2.4 ELISA法測(cè)定Leydig細(xì)胞分泌的睪酮含量 參照文獻(xiàn)方法[12-13]進(jìn)行前期方法學(xué)研究，對(duì)參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化。其中主要確定了細(xì)胞的鋪板密度，以及睪酮濃度與OD值呈線性的線性范圍。將細(xì)胞密度為105個(gè)/mL的睪丸間質(zhì)細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中(100 μL/孔)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后輕輕吸去培養(yǎng)液后給藥。樣品組每組分別加入海狗丸供試品溶液100 μL/孔(濃度分別為50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)，設(shè)5個(gè)復(fù)孔。空白對(duì)照組加入D-MEM/F12培養(yǎng)液100 μL/孔，設(shè)5個(gè)復(fù)孔。陽(yáng)性對(duì)照組加入含人絨毛膜促性腺激素(HCG)的D-MEM/F12培養(yǎng)液(含HCG終濃度為1 U/mL)100 μL/孔，設(shè)5個(gè)復(fù)孔。給藥后置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，并檢測(cè)給藥24 h后大鼠Leydig細(xì)胞分泌的睪酮含量，按照大鼠睪酮(T)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)逐步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值。

3 結(jié)果

3.1 睪丸間質(zhì)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)Leydig細(xì)胞增殖情況，得到海狗丸3個(gè)給藥濃度對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖影響情況見(jiàn)表1。在給藥24 h后，3個(gè)給藥濃度的海狗丸樣品均對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，且促進(jìn)作用隨給藥濃度升高而增強(qiáng)。其中低(50 μg/mL)、中(100 μg/mL)給藥濃度的海狗丸樣品的作用不明顯，與空白對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；而高濃度給藥實(shí)驗(yàn)組(200 μg/mL)、陽(yáng)性對(duì)照組分別與空白對(duì)照組相比較，存在極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，說(shuō)明對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用強(qiáng)。

組別給藥濃度OD值±標(biāo)準(zhǔn)差增值率/%海狗丸實(shí)驗(yàn)組200μg/mL0.75±0.02**44.2100μg/mL0.61±0.0917.350μg/mL0.56±0.117.7陽(yáng)性(HCG)對(duì)照組1U/mL0.72±0.03**38.5空白對(duì)照組-0.52±0.01-

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 ELISA法測(cè)定Leydig細(xì)胞分泌的睪酮含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 利用試劑盒做睪酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y=0.0343x+0.6566，R2=0.9995。檢測(cè)睪酮濃度在1.0～32.0 nmol/L時(shí)與OD值呈線性關(guān)系，如圖1所示。

3.2.2 睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的含量 將測(cè)得的OD值用標(biāo)準(zhǔn)曲線算出睪酮含量，并與空白對(duì)照組進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果顯示給藥24 h后，陽(yáng)性對(duì)照組(HCG)和海狗丸實(shí)驗(yàn)組(高、中、低3個(gè)濃度)與空白組相比，均不同程度的促進(jìn)了睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌量，見(jiàn)表2。在給藥24 h后，3個(gè)給藥濃度的海狗丸樣品，均具有促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的作用，且促進(jìn)作用隨給藥濃度增高而增強(qiáng)。分別與空白對(duì)照組相比較：其中低給藥濃度(50μg/mL)作用不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；中給藥濃度(100 μg/mL)就存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；而在200 μg/mL高給藥濃度時(shí)，促進(jìn)睪酮分泌的作用已優(yōu)于1 U/mL陽(yáng)性對(duì)照(HCG)，與空白組相比較有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

組別給藥濃度睪酮(T)OD值±標(biāo)準(zhǔn)差含量/nmol/L海狗丸實(shí)驗(yàn)組200μg/mL1.69±0.07**30.13100μg/mL1.25±0.09*17.3050μg/mL1.12±0.1313.51陽(yáng)性(HCG)對(duì)照組1U/mL1.57±0.04**26.63空白對(duì)照組-1.02±0.0210.59

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

睪丸間質(zhì)細(xì)胞分布于生精小管的結(jié)締組織中，主要具有合成和分泌睪酮的功能，其分泌睪酮的形式有基礎(chǔ)分泌和促性腺激素誘導(dǎo)分泌兩種。睪酮對(duì)于人類生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)性欲以及精子的生成進(jìn)而提高生育力等都具有十分重要的作用。鑒于睪酮在增強(qiáng)人體力量、性欲、免疫等功能的重要影響，且95%的血漿睪酮是由睪丸Leydig細(xì)胞分泌的[14]，故海狗丸的壯陽(yáng)生精活性與睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增值和睪酮分泌密切相關(guān)。研究采用體外培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞，應(yīng)用不同給藥濃度的海狗丸樣品處理，觀察對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞基礎(chǔ)分泌的變化和對(duì)細(xì)胞增殖情況的影響。

通過(guò)建立體外培養(yǎng)大鼠 Leydig 細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，以MTT法考察海狗丸對(duì)Leydig細(xì)胞的增殖作用，以ELISA方法檢測(cè)海狗丸對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中睪酮含量的影響，來(lái)考察海狗丸的體外壯陽(yáng)生精活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在設(shè)計(jì)劑量范圍內(nèi)，隨著給藥濃度的增加，對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)，其低(50 μg/mL)、中(100 μg/mL)給藥濃度的海狗丸樣品與空白對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而高濃度(200 μg/mL)給藥時(shí)就存在極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.01)。此外，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中睪酮的含量也隨給藥濃度的增加逐漸增加，且與空白對(duì)照組相比，100 μg/mL、200 μg/mL給藥濃度時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.05)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，一定濃度的海狗丸細(xì)胞給藥后能促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增值和睪酮(T)的分泌，給藥濃度的增大其促進(jìn)作用也越明顯。結(jié)果可知，海狗丸產(chǎn)品確實(shí)有一定的壯陽(yáng)生精活性，為海狗丸的藥效研究提供參考和實(shí)驗(yàn)支持。