付燕 張業(yè)廷 羅笑 胡小勇 謝璐霜 袁瓊嘉

1成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院（成都 610041）

2西南民族大學(xué)體育學(xué)院（成都 610041）

3成都中醫(yī)藥大學(xué)（成都 610041）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶以及其它認(rèn)知功能進(jìn)行性損毀，是引起老年人癡呆的最主要原因[1-3]。隨著全世界老年人口不斷增長(zhǎng)，AD已經(jīng)成為一個(gè)日益嚴(yán)峻的公共健康問題。AD的主要病理學(xué)特征是腦組織神經(jīng)元胞外β-淀粉樣蛋白（β-amyloid peptide，Aβ）沉積形成的老年斑、神經(jīng)元胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元死亡和突觸丟失，學(xué)習(xí)與記憶的關(guān)鍵腦區(qū)海馬等部位的病變尤為明顯[2，4]。盡管AD發(fā)病的確切原因與機(jī)制尚未完全闡明，但隨著相關(guān)研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到腦組織內(nèi)Aβ沉積誘發(fā)的免疫炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)在AD慢性進(jìn)行性病變中發(fā)揮著重要作用[5-8]。因此，抑制腦組織炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是降低AD風(fēng)險(xiǎn)的潛在治療目標(biāo)。但目前沒有任何具有抗炎作用的藥物被批準(zhǔn)用于治療持續(xù)性的炎癥性病變，更沒有任何方法可以治愈AD。

近些年來的許多研究表明，定期規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)是可以預(yù)防或緩解與慢性低水平系統(tǒng)性炎癥有關(guān)疾病的一種有效手段[9-11]。而來自人體流行病學(xué)調(diào)查與干預(yù)性實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)提示長(zhǎng)期規(guī)律的運(yùn)動(dòng)，尤其是有氧運(yùn)動(dòng)，對(duì)預(yù)防AD發(fā)生或延緩其病程具有積極作用[12-16]。我們推測(cè)，這種積極作用可能與有氧運(yùn)動(dòng)調(diào)控AD患者腦組織中Aβ沉積誘發(fā)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究采用直接經(jīng)雙側(cè)海馬注射凝聚態(tài)的Aβ1-42（一種體內(nèi)神經(jīng)毒性和致炎作用最強(qiáng)的Aβ肽鏈）的方式以誘導(dǎo)AD腦組織病理模型，并在Aβ1-42注射后給予大鼠規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)，然后觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化，并檢測(cè)海馬組織超微結(jié)構(gòu)以及促炎細(xì)胞因子、抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)情況，探討有氧運(yùn)動(dòng)能否通過調(diào)控Aβ誘發(fā)的海馬組織炎癥反應(yīng)狀態(tài)進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，阻止AD的發(fā)生或延緩AD病變的進(jìn)程，改善其學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能受損。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

3月齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠52只，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK[川]2015-030；動(dòng)物使用許可證：SYXK[川]2014-189）。大鼠飼養(yǎng)于成都體育學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室溫25±2℃，相對(duì)濕度40%～60%，自然光照，分籠飼養(yǎng)（3～4只/籠），自由攝取國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料和飲用冷開水。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后被隨機(jī)分成4組：空白對(duì)照組（K組），生理鹽水對(duì)照組（S組）、Aβ1-42誘導(dǎo)AD模型組（A組）、Aβ1-42+有氧運(yùn)動(dòng)組（AE組），每組13只。A組和AE組大鼠被給予雙側(cè)海馬注射凝聚態(tài)Aβ1-42（Sigma），S組大鼠則按同種方式注射同容積劑量生理鹽水（normal saline，NS），K組大鼠自然喂養(yǎng)。AE組大鼠Aβ1-42注射后第2天即開始進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)。

1.2 海馬A Aβ 1 1--4242/NS/NS注射方法

腹腔注射4%水合氯醛（10 ml/kg）將大鼠麻醉后固定于大鼠腦立體定位儀上；頭頂前后囟區(qū)域去毛后常規(guī)消毒，用眼科剪沿正中矢狀軸方向剪開頭皮0.5～1.0 cm，剝離骨膜，暴露出前囟及矢狀縫；參照諸葛啟釧翻譯的《大鼠腦立體定位儀圖譜》定位雙側(cè)海馬體注射點(diǎn)（定位坐標(biāo):前囟后3.0 mm，顱矢狀縫左右各旁開2 mm），用牙科鉆在左右定位處各鉆1小孔；將裝有Aβ1-42的10 μl微量注射器連接于固定在腦立體定位儀的微量推進(jìn)器上，從坐標(biāo)處垂直入顱，緩慢進(jìn)針至顱骨表面下4 mm；以0.5 μl/min的速度緩慢注入凝聚態(tài)的Aβ1-42或NS，每側(cè)各5 μl；注藥完畢后留針10 min再緩慢退針拔出；常規(guī)消毒、縫合，每天創(chuàng)口涂擦紅霉素軟膏至完全愈合。

1.3 有氧運(yùn)動(dòng)方案

AE組大鼠于海馬注射Aβ1-42前在電動(dòng)跑臺(tái)上進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng) 3天，8～10 m/min，15～20 min/d。正式跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練于海馬注射Aβ1-42后第2天開始，每日晚上8～10點(diǎn)進(jìn)行，共持續(xù)5周，每周訓(xùn)練6天，休息1天。訓(xùn)練第1周的前3天跑臺(tái)速度6～8 m/min，持續(xù)時(shí)間10～20 min/d；第1周的后3天跑臺(tái)速度10～12 m/min，持續(xù)時(shí)間30 min/d；第2～5周則在熱身運(yùn)動(dòng)（8～10 m/min，5 min）后將速度設(shè)置為15 m/min，持續(xù)時(shí)間 30 min/d。運(yùn)動(dòng)方案參考 Schefer等的文獻(xiàn)[17，18]制定。

1.4 Morrisorris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力

在海馬注射Aβ1-42/NS后第5周，按文獻(xiàn)[19，20]中的方法進(jìn)行Morris水迷宮（Morris water maze，MWM）實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力。MWM實(shí)驗(yàn)裝置由一個(gè)內(nèi)表面為黑色的圓形水池（直徑150 cm，高度60 cm）和信息采集分析系統(tǒng)組成。水池被平分為4個(gè)象限（分別標(biāo)注為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），其中象限Ⅳ（稱為“目標(biāo)象限”）中裝有一位置固定的圓形平臺(tái)（直徑9 cm，高度30 cm）。池水用無毒墨汁調(diào)為不透明狀態(tài)，水深沒過平臺(tái)1.5±0.5 cm，水溫22±1℃。水池的四周壁上貼有位置固定的方形、心形、三角形、圓形圖片為大鼠尋找水下平臺(tái)提供視覺線索。水池上方正中的攝像機(jī)同步采集大鼠的游泳軌跡，由水迷宮信息分析系統(tǒng)自動(dòng)分析記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。MWM實(shí)驗(yàn)的前6天，每天進(jìn)行4次定位航行訓(xùn)練，即將各大鼠頭朝下、面朝池壁分別從四個(gè)象限的邊緣中點(diǎn)放入水池，記錄大鼠的平均逃避潛伏期（大鼠從4個(gè)象限入水至爬上平臺(tái)的平均時(shí)間）以及游泳速度。如果訓(xùn)練時(shí)大鼠超過120 s尚未尋到水下平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)者會(huì)將其引至平臺(tái)并讓其在平臺(tái)上停留10 s，此時(shí)逃避潛伏期記錄為120 s。MWM實(shí)驗(yàn)的第7天，最后1次定位航行訓(xùn)練結(jié)束24 h后進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，即拆除目標(biāo)象限中的水下平臺(tái)，按照定位航行訓(xùn)練的方式將大鼠從水池第Ⅱ象限邊緣中點(diǎn)放入水池，記錄大鼠60 s內(nèi)在目標(biāo)象限中的時(shí)間以及穿越原平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)。

1.5 腦組織樣本采集和指標(biāo)檢測(cè)

腦組織樣本采集在Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24～48 h進(jìn)行。每組隨機(jī)取3只用于電鏡技術(shù)檢測(cè)，5只用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)，5只用于免疫印跡（western blot）分析。

1.5.1 超薄切片制作和電鏡技術(shù)檢測(cè)海馬組織超微結(jié)構(gòu)

使用10%水合氯醛（5 ml/kg體重）腹腔注射將大鼠麻醉后開胸，暴露心臟，將灌注針頭迅速插入大鼠左心室并剪開右心耳，經(jīng)左心室快速灌注NS，直至剪開的右心耳處流出液體變清亮后慢速灌注3%戊二醛溶液（4℃）；待大鼠四肢和尾巴強(qiáng)直僵硬后，斷頭取腦，冰上快速分離出海馬；在3%戊二醛中將海馬CA1區(qū)修成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，放入尖頭EP管中，加滿3%戊二醛，4℃固定過夜；0.01 M PBS充分沖洗后用1%四氧化鋨后固定2 h；用30～100%丙酮逐級(jí)脫水后將組織塊用Epon812包埋；半薄切片（0.5 μm）光學(xué)定位后進(jìn)行超薄切片（100 nm），超薄切片安裝于銅網(wǎng)格上用醋酸鈾及枸櫞酸鉛進(jìn)行雙重染色；透射電鏡（日立H-600IV）觀察并7000×倍數(shù)下采集圖片。

1.5.2 冰凍腦切片制作和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)促炎細(xì)胞因子（TNF-TNF-α 、IL-IL-1 1β ）、抗炎細(xì)胞因子（TGF-TGF-β 、IL-IL-1010）的表達(dá)

使用10%水合氯醛（5 ml/kg體重）腹腔注射將大鼠麻醉后開胸，暴露心臟，將灌注針頭迅速插入大鼠左心室并剪開右心耳，經(jīng)左心室快速灌注NS，直至剪開的右心耳處流出液體變清亮后慢速灌注4%多聚甲醛（4℃）至大鼠四肢僵硬，斷頭取出大腦，放入裝有預(yù)冷4%多聚甲醛的EP管中（4℃，＞4 h）；用10%、20%、30%蔗糖溶液進(jìn)行梯度脫水后將腦組織用OCT包埋劑進(jìn)行包埋；冠狀位連續(xù)切片至完整海馬腦區(qū)，厚度5 μm；將切片粘附在用明膠處理過的成品載玻片上，充分干燥；0.01M PBS浸泡洗滌5 min×3次后用5%小牛血清封閉液室溫封閉1 h后滴加一抗工作液（TNF-α，1∶300，Abcam；IL-1β，1∶200，Abcam；TGF-β，1∶200，Abcam；IL-10，1∶400，Abcam），4℃孵育過夜；0.01 M PBS洗滌5 min×3次后加入FITC標(biāo)記的二抗IgG（1∶1000，北京中杉），濕盒中室溫避光孵育2 h；0.01 M PBS避光洗滌10 min×3次后滴加DAPI工作液（1∶1000，北京中杉），37℃避光條件下孵育10 min；0.01M PBS避光漂洗5 min×3次后滴加抗熒光淬滅封片劑覆蓋封片，熒光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察并采集圖像。每個(gè)指標(biāo)每個(gè)樣本取5張切片（隔4取1），200×倍數(shù)下選取海馬互不重疊的3個(gè)視野進(jìn)行照相，用Image pro plus 6.0軟件分析平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）。

1.5.3 海馬蛋白質(zhì)提取和Western Blot Blot分析促炎細(xì)胞因子（TNF-TNF-α 、IL-IL-1 1β ）、抗炎細(xì)胞因子（TGF-TGF-β 、IL-IL-1010）的表達(dá)

將大鼠斷頭取腦，4℃生理鹽水清洗后在冰上快速分離出右側(cè)海馬組織放入尖頭EP管內(nèi)，按照每1 mg組織加入4℃的10 μl RIPA 裂解緩沖液（每1 ml RIPA 裂解液中加入40 μl蛋白酶抑制劑和10 μl PMSF溶液）中勻漿，12000 rpm/min、4℃離心10 min后取上清；采用BCA法檢測(cè)各樣本上清中的蛋白濃度；每個(gè)樣本取含定量蛋白的上清經(jīng)加熱變性處理后用SDS-PAGE凝膠（8～10%分離膠+5%濃縮膠）垂直電泳分離蛋白；電泳完成后將分離出的目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（PVDF）膜上；將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉處理后用一抗工作液（TNF-α，1∶200，Abcam；IL-1β，1∶200，Abcam；IL-10，1∶400，Abcam；TGF-β，1∶400，Abcam）孵育，4 ℃過夜；TBST液充分洗滌后用辣根酶標(biāo)記的二抗工作液（山羊抗鼠IgG，1∶2000，北京中杉）室溫孵育2 h；再TBST液充分洗滌后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，獲得目標(biāo)蛋白的印跡圖像。β-actin作為內(nèi)參。使用凝膠分析軟件Quantity One（Bio-Rad）對(duì)免疫印跡條帶進(jìn)行光密度分析，以目標(biāo)蛋白印跡條帶光密度值與內(nèi)參蛋白β-actin印跡條帶光密度值的比值作為目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組相關(guān)指標(biāo)值用平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示。P＜0.05被認(rèn)為組間差異具有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力變化情況

在定位航行訓(xùn)練中，隨著訓(xùn)練次數(shù)增加，各組大鼠平均逃避潛伏期時(shí)間均逐漸縮短，其中K組、S組在第3天表現(xiàn)出最優(yōu)異成績(jī)，即逃避潛伏期降到最短，隨后幾天與前1天相比沒出現(xiàn)顯著性差異，AE組和A組則分別在第4天和第5天后趨于穩(wěn)定（圖1a）。對(duì)各組大鼠每天的平均逃避潛伏期進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，K組和S組在整個(gè)定位航行訓(xùn)練期間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；A組從第2天起至訓(xùn)練結(jié)束，逃避潛伏期均顯著性長(zhǎng)于S組（第2、3、4天，P＜0.01；第5、6天，P＜0.05，圖1a）；AE組則在第2、4、5、6天顯著性短于A組（P＜0.05，圖1a）。在MWM空間探索實(shí)驗(yàn)中，A組大鼠在60 s內(nèi)穿越原有平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)與在目標(biāo)象限中停留的時(shí)間均比S組顯著性減少（P＜0.01），而S組和K組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與A組相比，AE組大鼠在目標(biāo)象限中停留的時(shí)間和穿越平臺(tái)的次數(shù)有所增加（P＜0.05）（圖1c、圖1d、圖1e）。而不管是在定位航行訓(xùn)練期間還是在空間探索實(shí)驗(yàn)中，各組間大鼠游泳速度均無顯著性差異（P＞0.05，圖1b），這排除了在MWM實(shí)驗(yàn)中的行為學(xué)差異是由于運(yùn)動(dòng)障礙造成的可能性。

2.2 大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化情況

在電鏡下可觀察到：K組和S組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元分布規(guī)整，胞膜結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)中線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器含量豐富，結(jié)構(gòu)正常，偶可見溶酶體，微絲微管排列規(guī)整；胞核形狀規(guī)則，核膜光滑完整，核仁清晰可見（圖2A、2B）；神經(jīng)突觸較多，結(jié)構(gòu)完整清晰，突觸囊泡密集而均勻（圖2a、2b）。A組神經(jīng)元胞膜有溶解斷裂現(xiàn)象，胞質(zhì)中線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器數(shù)量明顯減少，線粒體出現(xiàn)腫脹與空泡，部分線粒體嵴溶解消失；核膜皺縮、內(nèi)陷呈鋸齒樣變，染色質(zhì)固縮邊聚，并可見凋亡小體形成（圖2C）；神經(jīng)突觸分布較為稀少，部分突觸界限模糊，突觸囊泡稀疏（圖2c）；AE組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較A組有明顯改善，結(jié)構(gòu)完整的線粒體增多，仍有腫脹，但較A組有所減輕（圖2D）；突觸數(shù)量有所增加，突觸輪廓較為清晰，突觸間隙融合現(xiàn)象減輕，突觸囊泡增多（圖2d）。

2.3 大鼠海馬促炎細(xì)胞因子TNF-TNF-α 、IL-IL-1 1β 的表達(dá)情況

在免疫熒光顯微鏡下觀察，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）和白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）熒光陽性物質(zhì)在S組與K組大鼠的海馬組織非常稀疏，而在A組和AE組的分布則較為密集，熒光強(qiáng)度明顯增加（圖3a，200倍）。對(duì)TNF-α和IL-1β的MFI進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，S組與K組均無顯著性差異；與S組相比，A組與AE組兩者的MFI明顯增高（P＜0.01）；而AE組較A組有所降低（P＜0.05，圖3b）。通過Western Blot對(duì)TNF-α和IL-1β進(jìn)行定量分析也支持這一變化趨勢(shì)（圖3c）。Western Blot分析結(jié)果顯示，A組TNF-α和IL-1β相對(duì)表達(dá)量分別較S組提高306.9%和 255.6%，AE組則分別提高179.3%、147.8% ；AE組TNF-α和IL-1β的相對(duì)表達(dá)量較A組分別降低了31.4%、25.0%。

圖1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 海馬組織電鏡檢測(cè)結(jié)果（7000×）

圖3 大鼠海馬促炎因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)

圖4 大鼠海馬抗炎因子IL-10和TGF-β表達(dá)

2.4 大鼠海馬抗炎細(xì)胞因子IL-IL-1010和TGF-TGF-β 的表達(dá)情況

在免疫熒光顯微鏡下觀察，白介素-10（interleukin-10，IL-10）和轉(zhuǎn)化 生 長(zhǎng) 因 子 -β（transforming growth factor-β，TGF-β）免疫熒光陽性物質(zhì)在S組與K組大鼠的海馬組織分布稀疏分布，熒光強(qiáng)度較弱；而在A組和AE組，免疫熒光陽性物質(zhì)明顯增加，除分布更為密集外，亮度也有所增強(qiáng)（圖4a，200倍）。對(duì)MFI進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示：在S組與K組之間，IL-10和TGF-β的MFI均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與S組相比，A組兩種分子的MFI有所增加（IL-10，P＜0.01；TGF-β，P＜0.05），而AE組大鼠則較A組大鼠出現(xiàn)進(jìn)一步增高（P＜0.01，圖4b）。Western Blot技術(shù)對(duì)IL-10和TGF-β進(jìn)行定量分析顯示同樣變化趨勢(shì)（圖4c），其中A組IL-10和TGF-β相對(duì)表達(dá)量比S組分別提高80.0%、78.3%；AE組比S組分別提高203.3%、147.8%，比A組則提高68.5%、39.0%。

3 討論

學(xué)習(xí)與記憶能力受損是AD病變最早出現(xiàn)的癥狀之一[1，2]，而導(dǎo)致AD患者學(xué)習(xí)記憶受損的原因與機(jī)制目前尚不完全清楚。不過隨著近年來研究的不斷深入，人們已逐漸認(rèn)識(shí)到Aβ沉積對(duì)腦組織神經(jīng)元的毒性作用可能是學(xué)習(xí)記憶受損的重要原因[8，21-24]。Aβ由淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）在β、γ分泌酶的作用下剪切而成[23，24]。正常情況下Aβ可以被及時(shí)降解和清除，而病理情況下（如腦老化、基因突變、APP代謝異常、腦損傷等）Aβ產(chǎn)生過多或者不能被及時(shí)清除時(shí)，就容易沉淀、聚集形成寡聚體和原纖維，引起不可逆性神經(jīng)元及其突觸的退化、死亡、消失，使患者腦信息處理和傳遞能力降低，突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性下降，最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)與記憶功能障礙而引起癡呆[8，21-24]。腦組織中內(nèi)源性Aβ主要有 Aβ1-40和 Aβ1-42兩種形式，其中Aβ1-40含量最多，但Aβ1～42因其更難溶解、更容易積聚形成原纖維和寡聚體而具有更強(qiáng)的神經(jīng)毒性[24]。研究發(fā)現(xiàn)，向腦組織內(nèi)直接注射Aβ可使動(dòng)物產(chǎn)生學(xué)習(xí)和記憶功能障礙，出現(xiàn)行為學(xué)改變，并產(chǎn)生與AD相似的神經(jīng)病理變[25]。因此，向腦組織內(nèi)直接注射Aβ，被認(rèn)為能夠誘導(dǎo)AD腦組織病理的動(dòng)物模型并被廣泛用于AD防治策略及其神經(jīng)機(jī)制探討的相關(guān)研究中[26-28]。本實(shí)驗(yàn)在直接向大鼠雙側(cè)海馬注射Aβ1-42后第5周所進(jìn)行的MWM水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與生理鹽水對(duì)照組（S組）大鼠相比，海馬注射Aβ1-42的大鼠（A組）不管是空間參考學(xué)習(xí)能力還是記憶提取能力均表現(xiàn)出明顯下降。而眾所周知，海馬是空間學(xué)習(xí)與記憶功能的關(guān)鍵腦區(qū)。隨后對(duì)大鼠海馬組織進(jìn)行電鏡技術(shù)觀察則發(fā)現(xiàn)，A組大鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)細(xì)胞受損，神經(jīng)突觸數(shù)量減少，突觸囊泡稀疏。而同樣方式注射生理鹽水的大鼠（S組）則沒有觀察到明顯的海馬神經(jīng)元和突觸受損現(xiàn)象。這提示本實(shí)驗(yàn)采用的雙側(cè)海馬直接注射Aβ1-42成功地誘導(dǎo)出AD海馬組織病理模型。

越來越多的證據(jù)顯示，AD患者的腦組織中伴隨著慢性進(jìn)行性炎癥反應(yīng)，并且這些炎癥反應(yīng)在AD病理變化中發(fā)揮重要作用[5，29]。AD患者和相關(guān)動(dòng)物模型的腦組織檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)，一些炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-1β、白介素-6（interleukin-6，IL-6）等促炎癥細(xì)胞因子在AD患者腦組織中明顯增加[5，29]。TNF-α和IL-1β被證實(shí)不僅直接對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，還是免疫反應(yīng)的發(fā)起者和關(guān)鍵介質(zhì)，可以進(jìn)一步激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)其它促炎因子和趨化因子的產(chǎn)生，啟動(dòng)多種介質(zhì)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，形成惡性循環(huán)，產(chǎn)生慢性進(jìn)行性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致不可逆性神經(jīng)元退化、突觸結(jié)構(gòu)與功能受損[30，31]。來自體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)資料顯示，Aβ對(duì)神經(jīng)元的毒性作用就與這些炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活有關(guān)[30-32]。本研究采用免疫熒光檢測(cè)以及Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，與S組相比，A組大鼠海馬的炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平均呈倍數(shù)增加，提示 Aβ1-42可引起海馬組織TNF-α和IL-1β促炎因子表達(dá)，使其處于炎癥狀態(tài)。值得注意的是，在促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平升高的同時(shí)，A組大鼠海馬組織的TGF-β和IL-10的表達(dá)水平也有所上調(diào)。TGF-β和IL-10等因能抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生及其活性而被通稱為抗炎細(xì)胞因子，它們的上調(diào)可以部分地抵消促炎細(xì)胞因子的作用，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能[30]。但由于抗炎細(xì)胞因子表達(dá)水平相對(duì)較低，并不足以抗衡促炎細(xì)胞因子所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過程及其神經(jīng)毒性作用，最終導(dǎo)致疾病慢性進(jìn)行性發(fā)展。

不管是AD還是其他神經(jīng)退行性疾病，由慢性炎癥過程介導(dǎo)的惡性破壞性循環(huán)被證明是難以遏制的，因而到目前為止尚未尋到治愈這類疾病的有效方法。不過有大樣本量的觀察性研究數(shù)據(jù)顯示，身體活動(dòng)水平和機(jī)體炎癥生物標(biāo)記物之間存在高度負(fù)相關(guān)關(guān)系[33，34]，并且一些干預(yù)性實(shí)驗(yàn)研究也表明規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)可以減少循環(huán)系統(tǒng)C反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）、IL-6、TNF-α等炎癥標(biāo)志分子濃度，使IL-4、IL-10、TGF-β等抗炎性細(xì)胞因子水平升高[35-38]，有效抑制身體各系統(tǒng)的慢性炎癥反應(yīng)，尤其是患有慢性疾病者。那么，有氧運(yùn)動(dòng)能否調(diào)控AD患者腦組織中Aβ沉積誘發(fā)的炎癥反應(yīng)進(jìn)而對(duì)AD發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，改善認(rèn)知功能？

來自人體流行病學(xué)數(shù)據(jù)提示，長(zhǎng)期規(guī)律的運(yùn)動(dòng)，尤其是有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)預(yù)防AD的發(fā)生或延緩其病程具有積極作用[13，14]。動(dòng)物研究也表明，運(yùn)動(dòng)對(duì)幾種AD動(dòng)物模型學(xué)習(xí)和記憶缺陷具有預(yù)防作用，如TgCRND8小鼠[39]、APP/PS1老鼠[15]、3×Tg-AD小鼠[40]、側(cè)腦室注射Aβ25-35誘導(dǎo)的AD模型[41]。本研究中，我們采用雙側(cè)海馬Aβ1-42注射以誘導(dǎo)AD模型，在給予大鼠雙側(cè)海馬Aβ1-42注射后即讓其進(jìn)行規(guī)律的從低到中等負(fù)荷的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)持續(xù)第5周時(shí)進(jìn)行的MWM水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與生理鹽水對(duì)照組（S組）相比，進(jìn)行規(guī)律有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組的大鼠（AE組）雖然空間學(xué)習(xí)與記憶能力依然有明顯受損，但顯著優(yōu)于沒有進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)的Aβ1-42模型組大鼠（A組）；而且，在電鏡下觀察，AE組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較A組有明顯改善，突觸數(shù)量也有所增加，突觸輪廓較為清晰，突觸囊泡較多。這表明規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Aβ1-42的毒性作用具有一定抑制效應(yīng)，可減輕因Aβ1-42毒性作用導(dǎo)致的神經(jīng)元受損及其空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙程度。

有文獻(xiàn)報(bào)道了規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)可以減少AD患者血清中IL-6、TNF-α等促炎因子的濃度[42]，但有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)AD病變腦組織部位過量的Aβ誘發(fā)的炎癥反應(yīng)的影響尚不清楚。為觀察有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Aβ誘發(fā)的炎癥反應(yīng)的影響，我們對(duì)海馬部位的促炎因子TNF-α和IL-1β以及抗炎因子IL-10、TGF-β等的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)和分析。不管是免疫熒光陽性物質(zhì)分布及熒光強(qiáng)度值，還是Western Blot對(duì)這些蛋白相對(duì)表達(dá)量的分析，結(jié)果均顯示AE組大鼠海馬組織的促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β表達(dá)水平比A組出現(xiàn)了明顯下調(diào)，而具有抗炎作用和神經(jīng)保護(hù)作用的抗炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β表達(dá)水平均則出現(xiàn)了顯著性增高。這表明5周規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)不僅可一定程度抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，還可促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子TGF-β、IL-10的表達(dá)，從而可在更高程度上抵消促炎細(xì)胞因子的炎癥損傷作用，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的平衡。這可能是本實(shí)驗(yàn)中有氧運(yùn)動(dòng)使Aβ1-42誘導(dǎo)的毒性反應(yīng)減弱，最終減輕因Aβ1-42毒性作用導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元受損以及空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙程度的機(jī)制之一。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用的雙側(cè)海馬直接注射Aβ1-42成功地誘導(dǎo)出AD海馬組織病理模型；長(zhǎng)期規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Aβ1-42的毒性作用具有一定抑制效應(yīng)，進(jìn)而減輕因Aβ1-42毒性作用導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元受損及其空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙程度；這種作用可能與有氧運(yùn)動(dòng)能抑制炎癥因子并同時(shí)促進(jìn)抗炎因子的表達(dá)，從而可在更高程度上抑制或抵消炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫平衡有關(guān)。有氧運(yùn)動(dòng)通過什么途徑抑制促炎細(xì)胞因子、促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。