(常熟市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 常熟 215500)

有85%的宮頸癌發(fā)生在包括中國(guó)在內(nèi)的發(fā)展中國(guó)家，從宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)進(jìn)展到宮頸癌需8～10年時(shí)間，在此時(shí)間窗內(nèi)篩查出宮頸癌前病變并進(jìn)行臨床干預(yù)，可以有效預(yù)防宮頸癌的發(fā)生。根據(jù)中國(guó)子宮頸癌綜合防控指南及中國(guó)子宮頸癌篩查及異常管理相關(guān)問題專家共識(shí)[1]，對(duì)中國(guó)適齡婦女進(jìn)行規(guī)范化的細(xì)胞學(xué)和/或高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus，hr-HPV))檢查初篩并進(jìn)行合理分流可以避免更多女性罹患宮頸癌。但我國(guó)細(xì)胞學(xué)篩查的總體覆蓋率僅21%，經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的基層醫(yī)院細(xì)胞病理醫(yī)生和分子實(shí)驗(yàn)醫(yī)生短缺，篩查難以覆蓋。鑒于目前中國(guó)的宮頸癌篩查現(xiàn)狀，探索適合經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的篩查方法，提高經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的宮頸癌篩查覆蓋率，對(duì)減少宮頸癌對(duì)經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)女性生殖健康的威脅有著積極意義。本研究旨在探討雙抗體夾心法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 測(cè)定宮頸分泌物中信號(hào)轉(zhuǎn)錄與活化因子3(signal transcription and activation factor 3，Stat3)和生存素(Survivin)蛋白含量在宮頸病變篩查中的價(jià)值，為經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的宮頸病變篩查提供新方法。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年12月至2017年10月常熟市第二人民醫(yī)院婦科門診薄層液基細(xì)胞學(xué)(thinprep cytologic test，TCT)和/或hr-HPV初篩結(jié)果異常行宮頸活檢的192例女性患者為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①已行TCT和/或hr-HPV檢測(cè)；②無宮頸癌及癌前病變治療史；③非經(jīng)期取材；④72小時(shí)內(nèi)無性生活、盆浴、陰道檢查、陰道沖洗及局部上藥史。

1.2方法

1.2.1宮頸分泌物標(biāo)本采集

用新柏氏長(zhǎng)柄宮頸刷刷取宮頸管分泌物，充分洗脫至新柏氏細(xì)胞保存液中，加組織蛋白萃取劑(裂解液)裂解細(xì)胞，4℃ 2 500轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取上清液，入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2實(shí)驗(yàn)器材與試劑

主要實(shí)驗(yàn)器材為：洗板機(jī)、酶標(biāo)儀、恒溫箱、旋渦混合器。主要實(shí)驗(yàn)試劑為：人Survivin和Stat3 ELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2.3 TCT及hr-HPV檢測(cè)

TCT檢查由本院病理科細(xì)胞學(xué)室副主任醫(yī)師以上的專職醫(yī)生閱片，采用2009年國(guó)際癌癥協(xié)會(huì)的伯塞斯達(dá)系統(tǒng)(the Bethesda system，TBS)對(duì)其進(jìn)行描述性診斷，以無明確診斷意義的不典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamous cells of undermined significance，ASCUS)以上為細(xì)胞學(xué)結(jié)果異常。采用廣東凱普生物科技股份有限公司的21種(HPV)分型檢測(cè)試劑盒(PCR-膜雜交法)進(jìn)行hr-HPV檢測(cè)，14種hr-HPV病毒亞型為16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68，以任意1種及以上hr-HPV陽性為陽性。受醫(yī)保政策和患者主觀因素的影響，行TCT篩查共186例，TCT 結(jié)果異常 142例。hr-HPV篩查共154例，陽性132例；ASCUS患者36例全部行hr-HPV檢測(cè)進(jìn)行分流， hr-HPV 陽性26例。TCT+hr-HPV篩查共148例。

1.2.4宮頸活體組織活檢病理檢查

對(duì)符合陰道鏡轉(zhuǎn)診指征的患者行陰道鏡下宮頸多點(diǎn)活檢組織病理學(xué)檢查。宮頸活檢組織病理檢查結(jié)果為慢性宮頸炎41例，CIN1級(jí)56例，CIN2級(jí)28例，CIN3級(jí)53例，子宮頸原位癌及微小浸潤(rùn)癌16例(均為鱗癌)。以病理級(jí)別最高者作為組織學(xué)的最后診斷。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)Stat3和 Survivin蛋白含量

嚴(yán)格按照試劑盒說明對(duì)192例患者進(jìn)行ELISA法Stat3和 Survivin蛋白含量測(cè)定。測(cè)Survivin和Stat3蛋白濃度分別為0.61～118.07pg/mL和0.037～0.353ng/mL，確定截?cái)嘀捣謩e為4.89pg/mL和0.040ng/mL。

1.2.6 結(jié)果判定

參照ACOG 2016年10月發(fā)布的子宮頸癌篩查指南[2]，二聯(lián)篩查方案以Survivin、Stat3陽性/TCT ASCUS以上，Survivin、Stat3陰性/TCT LSIL以上，Survivin、Stat3陰性/HR-HPV16、18陽性，Survivin/Stat3雙陽性，Survivin、Stat3陽性/其它12種hr-HPV陽性為陽性結(jié)果。三聯(lián)篩查方案以Survivin、Stat3陰性/TCT陰性/HPV16、18陽性，Survivin、Stat3陽性/TCT ASCUS以上 /其它12種hr-HPV陽性，Survivin、Stat3陰性/TCT LSIL以上/HPV陰性或陽性，Survivin和Stat3雙陽性/TCT陰性/hr-HPV陰性或陽性為陽性結(jié)果。以宮頸活檢病理結(jié)果為診斷金標(biāo)準(zhǔn)，比較Survivin和Stat3單獨(dú)及各種聯(lián)合篩查方案及TCT、hr-HPV和TCT+hr-HPV用于宮頸病變篩查的效能。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以宮頸活檢病理結(jié)果為診斷金標(biāo)準(zhǔn)，病理診斷高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSILs) 及以上組(CIN 2級(jí)、CIN 3級(jí)、子宮頸原位癌及鏡下早期浸潤(rùn)癌)為陽性組，低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesions，LSILs)及以下組(慢性子宮頸炎、CIN1級(jí))為陰性組。計(jì)算Survivin和Stat3各單獨(dú)和聯(lián)合篩查方案及TCT、hr-HPV和TCT+hr-HPV方案篩查HSILs+的靈敏度、特異度、約登指數(shù)、一致率、陽性預(yù)測(cè)值與陰性預(yù)測(cè)值及其95%的可信區(qū)間(95%CI)。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)理論頻數(shù)<1，n<40，P接近界值0.05時(shí)采用Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 Stat3、Survivin、hr-HPV單獨(dú)和聯(lián)合篩查方案效能比較

結(jié)果顯示：①單獨(dú)篩查方案中，Stat3方案的約登指數(shù)和一致率最高，篩查結(jié)果最為真實(shí)、可靠。②二聯(lián)篩查方案中，Stat3+hr-HPV方案與Survivin+Stat3方案一致率和約登指數(shù)接近，明顯高于其它二聯(lián)篩查方案，篩查結(jié)果比其它二聯(lián)篩查方案真實(shí)、可靠。③三聯(lián)篩查方案中，Stat3+TCT+hr-HPV方案的約登指數(shù)和一致率最高，真實(shí)性和準(zhǔn)確較其它三聯(lián)篩查方案好，見表1。

表1 Stat3、Survivin、hr-HPV單獨(dú)及聯(lián)合篩查方案效能比較[%(n/N)]

Table 1 Comparison of efficacy of Stat3 and survivin separate and combined screening with efficacy of TCT,

hr-HPV and TCT+hr-HPV schemes[%(n/N)]

2.2 三種方案的靈敏度和特異度比較

Stat3方案與TCT和hr-HPV方案的靈敏度和特異度比較顯示，3種方案的總體靈敏度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，總體特異度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。χ2分割法檢驗(yàn)比較，Stat3方案的特異度顯著高于TCT和hr-HPV方案(均P<0.05)，見表2和表3。

表2 Stat3方案與TCT和hr-HPV方案的靈敏度比較結(jié)果(n)

Table 2 Comparison of sensitivity of Stat3, TCT and

hr-HPV(n)

表3 Stat3方案與TCT和hr-HPV方案的特異度比較結(jié)果(n)

Table 3 Comparison of specificity of Stat3, TCT and

hr-HPV (n)

注：▲為三種方案的比較，★為Stat3與TCT比較，◆為Stat3與hr-HPV比較。

2.3 四種方案的總體靈敏度和特異度比較

Survivin+Stat3、Stat3+hr-HPV和Stat3+TCT+hr-HPV方案與TCT+ hr-HPV方案的靈敏度和特異度比較顯示，4種方案的總體靈敏度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，總體特異度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。χ2分割法檢驗(yàn)比較，Survivin+Stat3方案特異度顯著高于TCT+hr-HPV方案(P<0.05)，Stat3+hr-HPV和Stat3+TCT+hr-HPV方案與TCT+hr-HPV方案比較特異度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4和表5。Stat3+hr-HPV和Stat3+TCT+hr-HPV方案與TCT+hr-HPV方案比較約登指數(shù)(0.70/0.71/0.59)和一致率(84.42%/86.46%/79.73%)較好，篩查結(jié)果比TCT+hr-HPV方案真實(shí)、可靠。但這2種方案與Stat3方案比較， 靈敏度(95.95%/94.67%/92.40%)和特異度(73.75%/76.71%/73.00%)接近，增加了hr-HPV和TCT+hr-HPV檢測(cè)費(fèi)用，不符合衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)要求，故兩種方案并不能作為理想的宮頸病變聯(lián)合篩查方案。通過比較、分析，篩選Stat3和Survivin+Stat3方案為單獨(dú)和聯(lián)合篩查方案，下面將對(duì)Stat3和Survivin+Stat3方案的篩查效能及分流ASCUS的效能進(jìn)行進(jìn)一步比較分析。

表44種方案的靈敏度比較結(jié)果(n)

Table 4 Comparison of sensitivity of survivin+Stat3, Stat3+hr-HPV, Stat3+TCT+hr-HPV and TCT+hr-HPV(n)

表54種方案的特異度比較結(jié)果(n)

Table 5 Comparison of specificity of survivin+Stat3, Stat3+hr-HPV, Stat3+TCT+hr-HPV and TCT+hr-HPV(n)

篩查方案 篩查結(jié)果 陽性陰性合計(jì)特異度(%) 95%CI 下限 上限Stat3+hr-HPV21598073.750.732 0.743Survivin+Stat316829883.670.833 0.840Stat3+TCT+hr-HPV 18567476.710.762 0.773TCT+hr-HPV26487464.860.641 0.656χ28.10▲/1.43★/8.08◆/2.07●P0.04▲/0.24★/0.02◆/0.18●

注：▲為4種方案的比較，★為Stat3+hr-HPV與TCT+hr-HPV比較，◆為Survivin+Stat3與TCT+hr-HPV比較，●為Stat3+TCT+hr-HPV與TCT+hr-HPV比較。

2.4 Stat3與Survivin+Stat3方案的靈敏度和特異度比較

Stat3與Survivin+Stat3方案靈敏度和特異度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表6和表7。

表6 Stat3與Survivin+Stat3方案的靈敏度比較

結(jié)果(n)

Table 6 Comparison of sensitivity of Stat3 and survivin+Stat3(n)

篩查方案 篩查結(jié)果 陽性陰性合計(jì)靈敏度(%) 95%CI 下限 上限Stat38579292.400.922 0.926Survivin+Stat384109489.360.892 0.896χ20.51P0.49

表7 Stat3方案與Survivin+Stat3方案的特異度比較結(jié)果(n)

Table 7 Comparison of specificity of Stat3 and survivin+Stat3(n)

篩查方案 篩查結(jié)果 陽性陰性合計(jì)特異度(%) 95%CI 下限 上限Stat3277310073.000.726 0.735Survivin+Stat316829883.670.833 0.840χ23.32P0.08

2.5 Stat3和Survivin+Stat3方案與hr-HPV方案在ASCUS分流中的效能比較

3種分流方案的總體靈敏度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher確切概率法檢驗(yàn)，P=0.02)。Stat3方案與hr-HPV方案比較靈敏度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher確切概率法檢驗(yàn)，P=0.24)，Survivin+Stat3方案的靈敏度顯著低于hr-HPV方案(Fisher確切概率法檢驗(yàn)，P=0.049)，見表8。

3種分流方案的總體特異度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Stat3與hr-HPV方案比較，特異度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Survivin+Stat3方案與hr-HPV方案比較，特異度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表9。

表8 Stat3和Survivin+Stat3方案與hr-HPV方案

在ASCUS分流中的靈敏度比較結(jié)果(n)

Table 8 Comparison of sensitivity of Stat3 and survivin+Stat3 and hr-HPV in ASCUS triage(n)

注：▲為3種方案的比較，★為Stat3與hr-HPV比較，◆為Survivin+Stat3與hr-HPV比較；均為Fisher檢驗(yàn)。

表9 Stat3和Survivin+Stat3方案與hr-HPV方案在ASCUS分流中的特異度比較結(jié)果(n)

Table 9 Comparison of specificity of Stat3 and Survivin+Stat3 and hr-HPV in ASCUS triage(n)

注：▲為3種方案的比較，★為Stat3與hr-HPV比較，◆為Survivin+Stat3與hr-HPV比較。

3討論

3.1 Stat3和Survivin在宮頸癌發(fā)生中的作用

Survivin是一種凋亡抑制基因，與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，本人研究發(fā)現(xiàn)Survivin 與亞洲人口CIN的進(jìn)展有關(guān)[3]。另有研究發(fā)現(xiàn)Survivin 是hr-HPV持續(xù)感染的分子標(biāo)記物，對(duì)宮頸癌和CIN的診斷有重要價(jià)值[4]， Survivin的表達(dá)量依賴于HPVE6/E7 的持續(xù)性表達(dá), 沉默HPV E6/E7 基因的表達(dá)可使Survivin表達(dá)下調(diào)[5]。Stat3是一種原癌蛋白，磷酸化的Stat3(phosphorylation of Stat3，p-Stat3)具有生物學(xué)功能。Stat3通過控制干細(xì)胞的自我更新，造成HPVE6癌蛋白選擇性地過表達(dá)，促進(jìn)子宮頸癌發(fā)生[6]。研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞株及宮頸癌組織中均存在p-Stat3的表達(dá)上調(diào)，并伴有下游凋亡抑制基因survivin的表達(dá)上調(diào)， 用Jak2 特異性抑制劑AG490抑制Stat3活化可造成survivin的表達(dá)下調(diào)[7]。Shirish等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)Stat3的持續(xù)性活化與HPV陽性宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，抑制 Stat3的表達(dá)或活化可使HPV陽性細(xì)胞株 E6和 E7 基因表達(dá)抑制，宮頸癌細(xì)胞株失活。通過以上研究，可以明確Stat3和Survivin在HPV陽性宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起協(xié)同作用，其作用機(jī)制為Stat3的持續(xù)性活化導(dǎo)致了hr-HPV的持續(xù)性感染，HPVE6/E7過表達(dá)，啟動(dòng)致癌過程，Survivin表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞異常增殖，上皮病變進(jìn)展為CINⅡ～Ⅲ級(jí)，最終導(dǎo)致了子宮頸癌的發(fā)生。這為檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞中Stat3和Survivin蛋白用于宮頸病變篩查提供了理論依據(jù)。

3.2 Stat3和Survivin在宮頸病變篩查中的價(jià)值

ELISA法為最廣泛應(yīng)用的臨床疾病診斷檢測(cè)方法之一，快速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員無需特殊培訓(xùn)，可在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的基層醫(yī)院推廣使用，可從一定程度上彌補(bǔ)經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)基層醫(yī)院細(xì)胞病理醫(yī)生缺乏的局限性，并作為臨床宮頸疾病篩查一項(xiàng)重要的輔助檢查。2010年，張?zhí)N霞等研究發(fā)現(xiàn)檢測(cè)宮頸分泌物中Survivin蛋白含量用于宮頸癌篩查的靈敏度(85.0%)與TCT(83.3%)比較無差異，特異度(97.8%)明顯高于TCT(76.1%)，認(rèn)為檢測(cè)宮頸分泌物中Survivin含量是一種比較好的宮頸癌輔助診斷方法。王冰玉[10]研究發(fā)現(xiàn)ELISA法測(cè)定宮頸分泌物中Survivin蛋白含量聯(lián)合TCT檢查診斷宮頸高級(jí)別病變的靈敏度為96.77%，特異度為75.51%，高于TCT和HPV聯(lián)合篩查(93.55%和22.45%)。

本研究結(jié)果顯示， Stat3方案的篩查效能高于Survivin，與TCT和hr-HPV方案比較篩查HSILs+的靈敏度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，特異度顯著高于TCT和hr-HPV方案(P<0.05)，且約登指數(shù)、一致率和陽性預(yù)測(cè)值均高于TCT和hr-HPV方案(P<0.05)，誤診率和陰道鏡轉(zhuǎn)診率比TCT降低32.55%和13.21%，比hr-HPV降低47.36%和19.83%。說明 Stat3方案比TCT和hr-HPV方案篩查結(jié)果真實(shí)、可靠，可以有效降低誤診率，減少不必要的陰道鏡轉(zhuǎn)診。Stat3方案用于ASCUS分流篩查HSILs+的靈敏度雖低于hr-HPV方案(P>0.05)，但有良好的特異度和陽性預(yù)測(cè)值，能降低33.33%的誤診率和16.35%的陰道鏡轉(zhuǎn)診率，比hr-HPV用于ASCUS分流效能更高，有望作為新的ASCUS分流方案。Survivin+Stat3方案與TCT+hr-HPV方案比較，篩查HSILs+的靈敏度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，靈敏度、約登指數(shù)、一致率和陽性預(yù)測(cè)值高于TCT+hr-HPV方案，篩查結(jié)果比TCT+hr-HPV方案真實(shí)、可靠，誤診率和陰道鏡轉(zhuǎn)診率比TCT+hr-HPV方案降低18.90%和11.08%，簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、易于普及，有望作為新的宮頸病變篩查方案。Survivin+Stat3方案在ASCUS分流中雖特異度高于hr-HPV方案，但靈敏度低(66.67%)，作為ASCUS分流方案漏診率高(33.33%)，故不宜作為ASCUS分流方案。

Stat3單獨(dú)篩查方案靈敏度(92.40%)略高于Survivin+Stat3聯(lián)合篩查方案(89.36%)，但特異度(73.00%)、約登指數(shù)(0.65)、一致率(82.29%)和陽性預(yù)測(cè)值(75.89%)均低于Survivin+Stat3聯(lián)合篩查方案，說明Survivin+Stat3聯(lián)合篩查方案結(jié)果比Stat3單獨(dú)篩查方案更真實(shí)、可靠，效能更高。Stat3單獨(dú)篩查方案靈敏度(92.40%)和陰性預(yù)測(cè)值(91.25%)高，漏診率低，能為篩查結(jié)果陰性的患者提供比較可靠的安全篩查間隔，適合用于宮頸病變篩查，Survivin+Stat3聯(lián)合篩查方案特異度(83.76%)和陽性預(yù)測(cè)值(84.00%)好，誤診率和陰道鏡轉(zhuǎn)診率低，適合用于宮頸病變?cè)\斷。

考慮到我國(guó)經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)細(xì)胞學(xué)篩查和hr-HPV篩查難以覆蓋的現(xiàn)狀、患者的經(jīng)濟(jì)承受能力和篩查方案在不同地區(qū)推廣的可行性， 認(rèn)為Stat3方案適合于經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的宮頸病變篩查和ASCUS分流， Survivin+Stat3方案適合于經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的宮頸病變?cè)\斷。

如本研究篩查方案能作為宮頸癌篩查策略用于經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)和人群的宮頸病變篩查和診斷，有可能會(huì)增加經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的宮頸癌篩查覆蓋率，提高經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的宮頸癌篩查效能，減少誤診和不必要的陰道鏡轉(zhuǎn)診，有望逐漸減小宮頸癌對(duì)發(fā)展中國(guó)家女性健康的威脅。