李嘉欣，韓東衛(wèi)，朱蕾，葛鵬玲

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

花旗澤仁是臨床治療2型糖尿病胰島素抵抗(IR)的經(jīng)驗(yàn)方。澤瀉為本方主要藥物之一，具有利水、滲濕、泄熱之功。澤瀉醇A-24-醋酸酯為澤瀉的主要活性成分之一，具有明顯的利尿、降血糖、降血脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗脂肪肝、免疫調(diào)節(jié)等功效[1-5]。

本研究基于HPLC-MS/MS技術(shù)，建立靈敏而可靠的方法檢測花旗澤仁中主要活性成分——澤瀉醇A-24-醋酸酯的血漿藥物濃度，研究正常大鼠灌胃花旗澤仁全方及單味藥澤瀉水煎液后的藥代動(dòng)力學(xué)過程；比較復(fù)方花旗澤仁及單味藥澤瀉中澤瀉醇A-24-醋酸酯在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)差異。揭示配伍用藥后復(fù)方中其他成分對澤瀉醇A-24-醋酸酯在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過程的影響，為進(jìn)一步研究花旗澤仁的體內(nèi)代謝和配伍規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品及試劑

西洋參、澤瀉、薏苡仁飲片(黑龍江省世一堂中藥飲片廠)；澤瀉醇A-24-醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)品(成都MUST生物技術(shù)有限公司)；地西泮標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)。

1.2 儀器

液相色譜/四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；VORTEX-GENIE 2渦旋混合儀(美國Scientific公司)；Centrifuge 5417R低溫高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf AG公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠12只，雄性，3月齡，體質(zhì)量(200±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(黑)2013-004。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，明暗周期12 h，房間溫度(20±2)℃，相對濕度50%左右，空氣新鮮，通風(fēng)良好，勤換墊料，自由攝食和飲水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 花旗澤仁水煎液的制備

取花旗澤仁中各藥材，浸泡12 h，第1次加12倍水煎煮，水沸后文火煎煮1 h；第2次加8倍水煎煮，水沸后文火煎煮45 min；第3次加6倍水，水沸后文火煎煮30 min，合并3次水煎液，過濾后水浴濃縮至每毫升含0.54 g生藥藥液，4℃保存，使用前水浴加溫至37℃。

2.2 儲(chǔ)備液的配制

精密稱取地西泮(Diazepam)5 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度為200 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。精密稱取澤瀉醇A-24-醋酸酯0.4 mg、4 mg、2 mg，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制得濃度分別為40 μg/mL、400 μg/mL、200 μg/mL的儲(chǔ)備液。所有儲(chǔ)備液均置于-20℃保存。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密移取各儲(chǔ)備液適量，以甲醇配成濃度如下的混合工作溶液：0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1、2、4 μg/mL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品的配制

將上述濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用空白血漿進(jìn)行1∶20稀釋,得到0.001～0.2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品。

2.5 質(zhì)控(quality control，QC)樣品的配制

QC樣品同法稀釋配制，濃度為0.002、0.02、0.16 μg/mL。

2.6 液相色譜條件

色譜柱為C18柱(1.8 μm，100 mm×3.0 mm，Agilent Technologies，美國)，流速0.3 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣體積10 μL;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4℃;流動(dòng)相：A相為水(含0.1%甲酸)，B相為乙腈。

澤瀉醇A-24-醋酸酯洗脫方式為梯度洗脫，每個(gè)樣品的分析周期為12 min。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相洗脫程序

2.7 質(zhì)譜檢測條件

采用ESI-離子源，離子源電壓3 500 V、霧化器流速10 L/min、霧化器溫度350℃、干燥氣溫度350℃、干燥氣流速10 L/min、掃描頻率2 amu/s、掃描范圍100～1 300 amu、霧化器壓力50 V、毛細(xì)管電壓3 500 V，質(zhì)譜參數(shù)577.368 1。

2.8 血漿樣品采集

取雄性SD大鼠12只，隨機(jī)分為兩組，即澤瀉組與花旗澤仁組(n=6)，給藥前禁食12 h，自由飲水，分別灌胃給予澤瀉水煎液與花旗澤仁水煎液，劑量為澤瀉組1 mL/100 g，花旗澤仁組1 mL/100 g體質(zhì)量。于給藥前及給藥后0.25、0.5、0.75，1、2、3、4、6、8、12、24、48 h由眼眶靜脈叢取血約0.5 mL，肝素抗凝，4 000 rpm離心5 min后取血漿，于-80℃保存,待測。

2.9 血漿樣品處理

移取100 μL血漿樣品，加入500 μL含地西泮(0.1 μg/mL)的甲醇溶液進(jìn)行蛋白沉淀，渦旋2 min，4℃ 12 000 rpm離心10 min，移取上清液于30℃氮?dú)饬飨麓蹈桑跉堅(jiān)屑尤爰状?00 μL，渦旋使復(fù)溶，12 000 rpm離心10 min，取上清液進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，進(jìn)樣體積為10 μL。

2.10 方法學(xué)考察

2.10.1 選擇性

取6個(gè)空白來源的血漿，加入澤瀉醇A-24-醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)樣品制成濃度為0.2 μg/mL，并與空白血漿一同處理進(jìn)樣分析，得到色譜圖。通過比較待測組分和內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)峰，判斷空白血漿中的內(nèi)源性成分是否對內(nèi)標(biāo)和待測組分存在干擾。

2.10.2 線性范圍和定量限(LLOQ)

將配制好的6組澤瀉醇A-24-醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品分別按照血漿處理方法進(jìn)樣分析，獲得待測組分與內(nèi)標(biāo)峰面積值。以澤瀉醇A-24-醋酸酯峰面積與內(nèi)標(biāo)物地西泮峰面積作比為縱坐標(biāo)y，以標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品濃度為橫坐標(biāo)x，分別采用1/x加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到澤瀉醇A-24-醋酸酯待測組分血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性回歸系數(shù)R2。

LLOQ為標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)，其響應(yīng)值應(yīng)滿足響應(yīng)信噪比為1∶10，且精密度表示為相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation，RSD)應(yīng)≤20%，準(zhǔn)確度表示為相對偏差(Relative error，RE)應(yīng)在±20%范圍內(nèi)。

2.10.3 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

將配制好的QC樣品分別按照血漿樣品處理方法進(jìn)樣分析，測得待測成分與內(nèi)標(biāo)峰面積A3。將不同個(gè)體的空白血漿樣品(n=6)按照血漿樣品處理方法操作后，加入與QC樣品同等濃度的澤瀉醇A-24-醋酸酯與內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣分析測得峰面積A2。將上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，得到峰面積A1。

基質(zhì)效應(yīng)為A2/A1；提取回收率為A3/A2，精密度RSD應(yīng)≤20%。

2.10.4 精密度和準(zhǔn)確度

將配制好的QC樣品分別按照血漿樣品處理方法進(jìn)樣分析，于同天進(jìn)行6次測定，得到3種待測組分及內(nèi)標(biāo)峰面積值，分別帶入回歸方程計(jì)算濃度值，求算日內(nèi)精密度與準(zhǔn)確度。連續(xù)3天進(jìn)樣分析，共得到18個(gè)濃度值，求算日間精密度和準(zhǔn)確度。

精密度表示為相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)≤20%，準(zhǔn)確度表示為相對偏差(RE)應(yīng)在±20%范圍內(nèi)。

2.10.5 樣品穩(wěn)定性

將配制好的QC樣品分別做如下處理：1)反復(fù)凍融3次后按照血漿樣品處理方法操作后進(jìn)樣分析；2)于室溫下25℃放置4 h后按照血漿樣品處理方法操作進(jìn)樣分析；3)置于-80℃冷凍2周后取出解凍后按照血漿樣品處理方法操作進(jìn)樣分析；4)按照血漿樣品處理方法操作后置于自動(dòng)進(jìn)樣器(4℃)12 h后進(jìn)樣分析。將上述測得峰面積值帶入回歸方程求算血藥濃度。

2.11 藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)處理

采用DAS2.0數(shù)據(jù)處理軟件的非房室模型法(統(tǒng)計(jì)矩法)進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tmax、Cmax、AUC0-t、t1/2、MRT0-t及CL等參數(shù)的計(jì)算。

統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用軟件SPSS 19.0進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 選擇性

圖1表明，在待測組分和內(nèi)標(biāo)的出峰位置，空白血漿中的其他內(nèi)源性成分不造成干擾。在上述分析條件下，澤瀉醇A-24-醋酸酯的保留時(shí)間為9.39 min，地西泮1. 67 min。

圖1 地西泮(1)、澤瀉醇A-24-醋酸酯(2) 血漿樣品色譜圖注：A為空白血漿；B為空白血漿標(biāo)準(zhǔn)添加LLOQ的待測組分和內(nèi)標(biāo)；C為給藥2 h后的實(shí)測血漿樣品

3.1.2 線性范圍與定量限

標(biāo)準(zhǔn)曲線在考察的下列濃度范圍內(nèi)顯示良好的線性關(guān)系，澤瀉醇A-24-醋酸酯：0.001～0.2 μg/mL。待測組分的平均回歸方程見表2。

將不同個(gè)體空白血漿新配LLOQ濃度點(diǎn)樣品并按照血漿處理方法進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，信噪比(S/N)為1∶10，精密度RSD<20%，準(zhǔn)確度RE在±20%范圍內(nèi)。LLOQ點(diǎn)的準(zhǔn)確度和精密度符合生物樣品分析要求，所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。

3.1.3 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

表3列出了低、中、高QC濃度的澤瀉醇A-24-醋酸酯和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率考察結(jié)果。在低、中、高濃度下，澤瀉醇A-24-醋酸酯存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，但在85%～115%范圍內(nèi)，精密度RSD<20%，不影響本分析方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，符合生物樣品分析要求。提取回收率結(jié)果顯示在血漿樣品前處理?xiàng)l件下，蛋白沉淀法對澤瀉醇A-24-醋酸酯的提取回收率>80%，因此血漿處理方法對澤瀉醇A-24-醋酸酯的提取回收率良好。

表2 待測組分的平均回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍與LLOQ(n=6)

注：Alisol A 24-acetate：澤瀉醇A-24-醋酸酯

表3 待測組分在大鼠血漿中的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率(n=6)

注：Alisol A 24-acetate：澤瀉醇A-24-醋酸酯；Diazepam：地西泮

3.1.4 精密度和準(zhǔn)確度

如表4所示，澤瀉醇A-24-醋酸酯日內(nèi)精密度(RSD)為4.0%～9.8%，日間精密度(RSD)為5.7%～8.1%，日內(nèi)與日間準(zhǔn)確度(RE)分別為1.6%～6.7%與-2.1%～4.6%；數(shù)據(jù)表明待測組分在大鼠的血漿中準(zhǔn)確度和精密度均符合分析要求。

表4 待測組分在大鼠血漿中的精密度和準(zhǔn)確度

注：Alisol A 24-acetate：澤瀉醇A-24-醋酸酯

3.1.5 樣品穩(wěn)定性

表5 待測組分在大鼠血漿中的穩(wěn)定性

注：Alisol A 24-acetate：澤瀉醇A-24-醋酸酯

如見表5所示，低、中、高3個(gè)QC濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的3次凍融循環(huán)后的穩(wěn)定性結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.8%～9.5%，相對偏差RE為-5.4%～7.6%；室溫下25 ℃放置4 h的短期穩(wěn)定性考察結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.0%～13.9%，相對偏差RE為-4.6%～4.9%；-80℃冷凍條件下保存2周的長期穩(wěn)定性結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.3%～9.1%，相對偏差RE為-8.7%～5.1%；以及樣品處理后置于自動(dòng)機(jī)進(jìn)樣器(4℃)中12 h的穩(wěn)定性結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為11.1%～13.8%，相對偏差RE為-2.4%～9.3%，RSD結(jié)果均小于20%，RE均在±20%范圍內(nèi)，表明待測組分在大鼠血漿中的穩(wěn)定性符合生物樣品的分析要求。

3.2 藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果

對兩組共12只SD大鼠一次分別灌胃澤瀉與花旗澤仁水煎液后，于系列時(shí)間點(diǎn)取血漿，并采用上述血漿樣品前處理方法操作后進(jìn)行進(jìn)樣分析，所測平均血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)見表6。主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果見表7，其平均血藥濃度-時(shí)間曲線如圖2。結(jié)果表明，花旗澤仁組與澤瀉組相比，藥時(shí)曲線下面積顯著增加，且依然成雙峰現(xiàn)象，清除率顯著降低，Cmax、Tmax、t1/2、MRT0-t均無顯著性差異。

表6 大鼠口服不同水煎液后澤瀉醇A-24-醋酸酯的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)

注：n.d.：未檢出，低于定量下限

表7 大鼠口服不同水煎液后澤瀉醇A-24-醋酸酯的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

注：與澤瀉組比較，*P<0.05

圖2 大鼠口服不同提取物后澤瀉醇A-24-醋酸酯 的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

4 討論

本實(shí)驗(yàn)樣品前處理選擇蛋白沉淀(PP)法，以甲醇作為沉淀劑，沉淀蛋白后以氮?dú)獯蹈蓾饪s進(jìn)樣分析。為提高實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)對血漿樣品前處理方法進(jìn)行篩選與優(yōu)化，考察3、4、5、6、7倍體積甲醇沉淀血漿蛋白后的質(zhì)譜響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)5倍體積的甲醇處理，能將澤瀉醇A-24-醋酸酯提取較為完全而稀釋較少，從而獲得最大的質(zhì)譜響應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，配伍后澤瀉的活性成分澤瀉醇A-24-醋酸酯的平均藥時(shí)曲線依然呈現(xiàn)明顯的雙峰現(xiàn)象，如圖2所示，達(dá)峰時(shí)間為1 h，但在6 h有明顯的濃度峰值，此前也有研究報(bào)道此雙峰現(xiàn)象的存在[6]。對于此現(xiàn)象的原因，可能是由于澤瀉醇A-24-醋酸酯經(jīng)腸道吸收進(jìn)入肝臟之后，通過膽汁排泄，隨膽汁到達(dá)小腸后被重吸收，即通過“肝腸循環(huán)”而產(chǎn)生。藥物吸收存在諸多因素的干擾，藥物性質(zhì)、生理學(xué)等方面的因素都可能造成不規(guī)則的藥物吸收現(xiàn)象的發(fā)生，例如肝腸循環(huán)、胃排空、胃腸蠕動(dòng)及藥物相互作用等[7]。

比較配伍前后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，在澤瀉單獨(dú)給藥組中，澤瀉醇A-24-醋酸酯于30 min血藥濃度就迅速達(dá)峰，然而在花旗澤仁組中其達(dá)峰時(shí)間延長至1 h出現(xiàn)第一個(gè)峰值，藥時(shí)曲線上吸收相明顯延長，表明配伍后可明顯改變其在大鼠體內(nèi)的吸收行為?；ㄆ鞚扇式M澤瀉醇A-24-醋酸酯藥時(shí)曲線下面積明顯增加，清除率CL比澤瀉組顯著降低，表明配伍可提高澤瀉醇A-24-醋酸酯在體內(nèi)的吸收程度，并減慢其清除率，延長澤瀉醇A-24-醋酸酯在體內(nèi)的作用時(shí)間，從而增強(qiáng)澤瀉醇A-24-醋酸酯降血脂[8]及其對胰島細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[9]。配伍用藥后，可能會(huì)間接影響胃腸蠕動(dòng)和胃排空的速率，胃腸道蠕動(dòng)的變化容易造成藥物吸收入血的差異，這可能是澤瀉醇A-24-醋酸酯AUC0-t明顯增加的機(jī)制之一。此外，由于中藥繁多的化學(xué)成分，可能是細(xì)胞色素P450(CYP/P450)的底物、抑制劑，或抑制作用占主導(dǎo)地位，從而對相互之間的藥代動(dòng)力學(xué)過程產(chǎn)生影響。

本實(shí)驗(yàn)通過探討澤瀉配伍為花旗澤仁對澤瀉醇A-24-醋酸酯藥代動(dòng)力學(xué)行為的影響，從藥代動(dòng)力學(xué)角度闡明花旗澤仁成藥性特征，為指導(dǎo)花旗澤仁臨床合理用藥提供參考，為獲得治療2型糖尿病胰島素抵抗的候選新藥奠定基礎(chǔ)。