張晨靜 屠江鋒 耿曉歌 高惠琴 王婧雅 潘文勝?

三陰性乳腺癌（TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體2（Her-2）均為陰性的乳腺癌，占全部乳腺癌的10%～20%［1］。其具有惡性程度高、對化療不敏感、易復發(fā)轉移、預后差等特點［2］。研究發(fā)現(xiàn)，實體腫瘤中存在一小群具有自我更新能力及多向分化潛能的腫瘤干細胞，不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移密切相關，且是腫瘤逃避常規(guī)治療手段，導致耐藥復發(fā)的原因［3］。轉化生長因子β（TGFβ）是一種多向性、多效性的細胞因子，以自分泌或旁分泌的方式通過細胞表面的受體信號轉導途徑參與細胞的增殖、分化、凋亡等調控［4］。研究表明TGFβ配體及其信號通路在多能干細胞的干性維持中發(fā)揮了重要作用［5］。本文探討TGFβ1對三陰性乳腺癌間質樣細胞表型的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 乳腺癌細胞系SUM159，MDA-MB231及SCP2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖細胞培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)箱中以37℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.2 細胞形態(tài)觀察 取對數(shù)生長期的乳腺癌細胞MDA-MB231，接種于6孔板中，接種密度為1×105細胞/孔。加入10ng/ml TGFβ1處理24h，光鏡下觀察細胞形態(tài)，拍照。

1.3 熒光定量PCR KRT8：上游引物序列為：5'CTAGGTGCGCGGATGGAAAT 3'；下游引物序列為：5'AGGTGGACACCTTGTAGGACT 3'。 KRT18：上游引物序列為：5' GATCATCGAGGACCTGAGGG 3'；下游引物序 列為：5' GTGTCATCAATGACCTTGCGG 3'。ACTA2： 上 游 引 物 序 列 為 ：5'TCGCATCAAGGCCCAAGAAA 3'；下游引物序列為：5'TTGTCACACACCAAGGCAGT 3'。KRT14：上游引物序列為：5' AGAACCTCAATGACCGCCTG 3'；下游引物序列 為 ：5' GTCCACTGTGGCTGTGAGAA 3'。GAPDH：上游引物序列為：5' TGGCCAAGGTCATCCATGAC 3'；下游引物 序列為：5' TGTCATACCAGGAAATGAGCTTG 3'。采用SsoFast? EvaGreen? Supermix（美國Bio-rad公司）染料法行RT-PCR擴增。以GAPDH為內參，校正每個樣本的Ct，計算△ct值，以2-△△ct計算基因表達。

1.4 Western-blot MDA細胞中加入細胞裂解液提取細胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司）測定蛋白濃度后，取30g樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，應用電轉儀將樣品轉移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉60min，加入小鼠抗人 CyclinD1單克隆抗體一抗（1：1000，美國abcam公司）。4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的羊抗小鼠IgG二抗（1：5000）室溫孵育120min，洗膜后化學發(fā)光 ECL法（美國Millipore公司）顯影，暗室曝光。以小鼠抗人β-actin（1：5000，美國CST公司）作為內參陽性對照。

1.5 動物實驗 實驗裸鼠由上海實驗動物中心提供，雌性，3～4周，SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)。取2×106乳腺癌與Matrigel（BD公司）混合懸液注射至裸鼠第二對乳房墊中，建立乳腺癌肝轉移模型。4～5周左右處死小鼠，取出小鼠肝臟，肉眼觀察乳腺癌白色轉移灶，后取部分肝臟組織用10%多聚甲醛固定。

1.6 HE染色 肝臟組織經(jīng)過多聚甲醛固定24h后，脫水、石蠟包埋、切片、組織脫蠟，蘇木素染液染核4 min，浸入自來水中1 min，0.5%鹽酸酒精分化，自來水沖洗1min，0.5%氨水返藍，自來水沖洗1min，伊紅胞漿染色1min，蒸餾水洗1min，乙醇脫水，二甲苯I透明 10min，二甲苯II透明 10min，用中性樹膠封片。

1.7 免疫組化染色 石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原修復，血清封閉置于37℃孵育30min，分別于小鼠抗人CyclinD1單克隆抗體一抗，兔抗人CDK4單克隆抗體一抗及兔抗人RB單克隆抗體一抗（美國abcam公司）4℃孵育過夜，PBS洗3次，二抗37℃孵育30min，PBS洗3次，加SABC后37℃孵育30min，PBS洗3次后加入顯色劑，將顯色后的片子置于水中沖洗后，浸于蘇木精中染色30s，脫水，封片。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS18.0 統(tǒng)計軟件。計量資料比較用t檢驗。以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TGFβ1促使三陰性乳腺癌間質樣干細胞表型改變情況 TGFβ1使細胞進一步呈現(xiàn)長梭樣改變（見圖1A）。伴隨著細胞形態(tài)的改變，乳腺癌腺導管上皮標志物 KRT8 及 KRT18 表達下降，而間質/肌上皮標志物 KRT14 及 ACTA2 表達上調（見圖1B）。同時，western-blot研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ1組SUM159中干性轉錄因子NANOG表達上調（見圖1C），提示 TGFβ1促進三陰性乳腺癌間質樣干細胞表型進一步發(fā)生改變。

2.2 TGFβ1通過上調cyclinD1/CDK4通路促進三陰性乳腺癌間質樣改變 經(jīng)過TGFβ1處理24h后，三陰性乳腺癌細胞SUM159中cyclinD1、CDK4、RB表達上調（見圖2A）。RT-PCR 對乳腺癌相關標志物分析發(fā)現(xiàn)，TGFβ1可以提高 KRT14 及 ACTA2 的表達，而降低 KRT8及KRT18基因的表達。而加入CDK4 抑制劑后這種作用被阻斷（見圖2B），提示cyclinD1/CDK4通路為TGFβ1促進并維持三陰性乳腺癌間質樣干細胞表型所必須。

圖1 TGFβ1促使三陰性乳腺癌間質樣干細胞表型情況

A：western-blot檢測對照組（ctrl）及TGFβ1組（TGFβ1）cyclinD1、CDK4、RB及內參表達；B：RT-PCR對乳腺癌相關標志物分析

2.3 TGFβ1誘導的乳腺癌間質樣干細胞表型促進裸鼠乳腺癌肝臟轉移 為進一步研究TGFβ1誘導的乳腺癌間質樣干細胞表型在裸鼠乳腺癌肝轉移中的作用，將對照組及經(jīng)過TGFβ1反復處理的乳腺癌MDA細胞注射到裸鼠第二對乳房墊中，建立乳腺癌肝轉移模型。4～5周左右處死小鼠，取出小鼠肝臟，并觀察乳腺癌白色轉移灶。結果顯示，與接種對照組MDA細胞（Ctrl）的裸鼠相比，接種TGFβ1反復處理組MDA細胞（TGFβ1）的裸鼠乳腺癌肝臟轉移灶顯著增加（見圖3A）。圖3B顯示為乳腺癌肝轉移灶HE染色。免疫組化顯示TGFβ1反復處理組乳腺癌肝臟轉移灶中cyclinD1表達上調（見圖3C）。

圖3 TGFβ1誘導的乳腺癌間質樣干細胞表型促進裸鼠乳腺癌肝臟轉移

3 討論

三陰性乳腺癌占所有乳腺癌類型的10%，近年來研究發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌中富含腫瘤干細胞，對傳統(tǒng)放化療不敏感，預后差，因此受到了醫(yī)學界的廣泛關注。前期研究發(fā)現(xiàn)，三種乳腺癌細胞SUM159、MDA及SCP2中CD44+CD24-含量較高，而CD44+CD24-干細胞多分布于侵襲性腫瘤邊緣，具有間質樣細胞形態(tài)，與細胞的局部侵襲乃至轉移密切相關［6］。近期研究表明TGFβ1配體及其信號通路在多能干細胞的干性維持中發(fā)揮重要作用。

為了進一步研究TGFβ1對乳腺癌間質樣細胞表型的作用及其機制，在本實驗中，應用TGFβ1 反復處理三種乳腺癌細胞SUM159、MDA及SCP2，并觀察細胞形態(tài)的變化。結果發(fā)現(xiàn)，TGFβ1促使三陰性乳腺癌細胞進一步間質樣改變。進一步研究發(fā)現(xiàn)TGFβ1通過上調cyclinD1/CDK4促進三陰性乳腺癌間質樣改變。細胞周期素D1（cyclinD1）屬于細胞周期正調控因子，研究發(fā)現(xiàn)cyclinD1在多種腫瘤中存在擴增及過度表達的現(xiàn)象，cyclinD1的過度表達常導致CDK4對視網(wǎng)膜母細胞瘤易感因子（Rb）的調節(jié)障礙，使其處于持續(xù)磷酸化狀態(tài)，釋放大量的生長調節(jié)因子E2F，導致細胞異常增殖［7-8］。而本實驗發(fā)現(xiàn)cyclinD1/CDK4通路在TGFβ1誘導的三陰性乳腺癌間質樣干細胞表型變化中也發(fā)揮重要作用。

本實驗在乳腺癌裸鼠轉移模型中進一步驗證發(fā)現(xiàn)，TGFβ1誘導的三陰性乳腺癌間質樣改變促進了乳腺癌肝臟轉移灶的數(shù)量，免疫組化染色進一步驗證了TGFβ1預處理組裸鼠肝轉移灶中cyclinD1陽性染色增加。這些結果提示TGFβ1通過上調cyclinD1/CDK4通路促進三陰性乳腺癌間質樣干細胞表型改變。同時，TGFβ1誘導的三陰性乳腺癌間質樣干細胞表型改變促進了裸鼠乳腺癌肝臟轉移。