周霞 黃效模 張一 曾德珍?

肝纖維化的形成機(jī)制是一個(gè)有眾多因素參與復(fù)雜的病理過程，肝纖維化實(shí)質(zhì)是慢性肝病損傷修復(fù)反應(yīng)，肝星狀細(xì)胞（HSC）在肝纖維化過程中起核心作用，各種原因肝損傷時(shí)，引起肝臟細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成增加，降解減少，進(jìn)而造成肝內(nèi)ECM不斷積聚，最后導(dǎo)致肝纖維化甚至肝硬化。TGFβ1是HSC活化最重要的因子之一［1］，目前大多數(shù)抗纖維化研究均以HSC為靶標(biāo)，2017年3月至12月作者通過實(shí)驗(yàn)研究，擬建立高表達(dá)TGFβ1的HSC陽性克隆，為肝纖維化的防治提供細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6由武漢協(xié)和醫(yī)院胃腸病實(shí)驗(yàn)室提供。pcDNA3.1（+）質(zhì)粒、感受態(tài)大腸桿菌DH-5ɑ購自武漢晶賽生物工程技術(shù)公司，限制性核酸內(nèi)切酶 NheI、XbaI、SmaI、Bg1II、EcoRI、T4多聚核苷酸激酶和Taq酶購自TAKARA公司，T4 DNA連接酶購自New England Biolabs，凝膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒購自寧波中鼎公司，寡核苷酸DNA單鏈由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 購自Invitrogen 公司，TRIzolTM Reagent 購自Invitrogen公司，新生SD大鼠由同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法 （1）質(zhì)粒構(gòu)建：根據(jù)已知的大鼠TGFβ1基因序列合成目的片段引物：TGFβ1引物： P1：5'-GGAATTCGCCACCATGGGCATGCCGCCCTCGGGG CT-3'，P2：5'-CCGCTCGAGTCAGCTGCACTTGCAGGA GCG-3'。TGF 1兩端有EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)。以大鼠cDNA為模板擴(kuò)增TGFβ1基因中1.2kb的目的基因片段，PCR反應(yīng)條件為：94℃變性5min進(jìn)入循環(huán)過程，94℃變性20s，60℃下退火25s，72℃延伸75s，循環(huán)32次后72℃復(fù)性3min，凝膠電泳回收TGFβ1產(chǎn)物，限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI酶切TGFβ1產(chǎn)物回收1.2kb的酶切產(chǎn)物。（2）表達(dá)載體構(gòu)建：TGFβ1酶切產(chǎn)物通過T4連接酶與EcoRI和XhoI酶切的質(zhì)粒pcDNA3.1（+）連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH-5ɑ，新霉素抗性篩選重組子pcDNA3.1（+）-TGFβ1，酶切鑒定成功后，菌液由上海英俊公司進(jìn)行測序分析。同時(shí)，用含綠色熒光蛋白的pcDNA3.1（+）-EGFP為陰性對照質(zhì)粒。（3）pcDNA3.1（+）-TGFβ1轉(zhuǎn)染HSC及G418的篩選：大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6含15%胎牛血清（FCS）的DMEM液，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1d，將HSC-T6細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后，將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，操作按脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染手冊進(jìn)行。取一試管加入質(zhì)粒2μg，用250μl Opti-MEM 培養(yǎng)基混合稀釋，另一試管加入脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 5μl，用250μl Opti-MEM培養(yǎng)基混合稀釋。室溫?zé)o菌條件下放置5min，兩試管混合后放置20min，在6孔板中每孔加入量為500μl混合液培養(yǎng)4h，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48h后計(jì)算轉(zhuǎn)染率，并改用含400μg/mlG418培養(yǎng)基，15%FCS的DMEM培養(yǎng)液2ml，6d后細(xì)胞大部分凋死，G418濃度減至200μg/ml維持篩選，殘存細(xì)胞約16d后形成陽性克隆，更換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)和傳代。并將細(xì)胞分為pcDNA3.1（+）-TGFβ1轉(zhuǎn)染組，pcDNA3.1（+）-EGFP轉(zhuǎn)染組，未傳代及轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白組，正常培養(yǎng)傳代21d的空白組細(xì)胞為陰性對照組。（4）熒光定量PCR檢測TGFβ1mRNA的表達(dá)：篩選陽性克隆后，繼續(xù)培養(yǎng)48h，用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，熒光定量PCR法分別擴(kuò)增TGFβ1mRNA。按定量RT-PCR試劑盒說明取1μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以Sybr Green I作為熒光標(biāo)記物，在LightCycler熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀（Roche公司，德國）上進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR引物：TGFβ1：5'-GAGGCGGTGCTCGCTTTGTA-3'，下游引物 5'-TTGTTGCGGTCCACCATTAGC-3'。反應(yīng)條件如下：預(yù)變性94℃ 3min，50個(gè)循環(huán)中94℃ 30s，53℃30s，72℃ 30s，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，CT法進(jìn)行相對定量。（5）Western blot法測定TGF-β1的表達(dá)：收集各組細(xì)胞，消化后加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，置冰上30min，4℃、12000g離心，取上清液進(jìn)行蛋白分光光度儀定量（考馬斯亮蘭法），每組取20μg蛋白加熱變性后，10%SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，含5%脫脂奶粉的Tris鹽溶液封閉2h，加入1：200稀釋的一抗兔抗TGFβ1多克隆抗體，4℃孵育過夜。用含吐溫-20的Tris鹽溶液洗膜3次，加入1：5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫下孵育1h?；瘜W(xué)發(fā)光法（ECL）檢測條帶。β-actin作為內(nèi)參。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，并計(jì)算機(jī)掃描電泳圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用（±s）表示，用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定 重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-TGFβ1用BamHI酶切，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后可見1.2kb的清晰條帶，進(jìn)行測序結(jié)果與GenBank所提供的序列完全相同，提示含有TGFβ1基因的pcDNA3.1（+）構(gòu)建成功。見圖1。

圖1 重組pcDNA3.1（+）-TGFβ1BamHI單酶切鑒定結(jié)果

2.2 脂質(zhì)體對Lipofectamine 2000對細(xì)胞毒性作用的G418篩選 應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 200 pcDNA3.1（+）-TGFβ10轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞后鏡下觀察顯示，在5μl的用量下HSC-T6細(xì)胞轉(zhuǎn)染前、后的形態(tài)和數(shù)目與對照組及空白組無明顯差異，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48h后測得轉(zhuǎn)染率為28.2%。篩選結(jié)果顯示，G418篩選試劑的最佳濃度為400μg/ml，應(yīng)用21d后可篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆，并能進(jìn)一步培養(yǎng)傳代。見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染48h EGFP的表達(dá)

2.3 TGFβ1mRNA的表達(dá)情況 熒光定量PCR法檢測TGFβ1的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示：pcDNA3.1（+）-TGFβ1轉(zhuǎn) 染 組 TGFβ1的 mRNA 表 達(dá) 較 pcDNA3.1（+）-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白組及對照組明顯增高［（20.220±0.879）vs（9.609±1.607）vs（5.122±3.512）vs（6.213±0.259），P＜0.05］。

圖3 Wester blot 法檢測各組TGFβ1蛋白的表達(dá)

2.4 TGFβ1蛋白的表達(dá)情況 Western blot印跡法檢測TGFβ1蛋白表達(dá)。TGFβ1在SDS-PAGE凝膠電泳中表現(xiàn)為46KD的條帶，實(shí)驗(yàn)顯示：pcDNA3.1（+）-TGFβ1轉(zhuǎn)染組TGFβ1蛋白的表達(dá)較pcDNA3.1（+）-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白組及對照組明顯增高［（0.968±0.822）vs（0.319±0.083）vs（0.211±0.024）vs（0.250±0.086），P＜0.05］。見圖 3。

3 討論

肝纖維化指肝臟纖維結(jié)締組織的過度沉積，是ECM合成和降解不平衡的結(jié)果，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展所共有的病理改變和必經(jīng)途徑。早期肝纖維化經(jīng)治療可以逆轉(zhuǎn)［2］，因此深入開展肝纖維化形成機(jī)制的研究有十分重要的意義。目前認(rèn)為HSC的激活是肝纖維化形成機(jī)制的中心環(huán)節(jié)。慢性肝損害過程中，大量細(xì)胞因子通過介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間，基質(zhì)-細(xì)胞間相互作用影響HSC，激活并促使HSC大量合成ECM，導(dǎo)致ECM過分沉積出現(xiàn)肝纖維化。在HSC的激活、致纖維化以及與其他細(xì)胞的相互作用的過程中，多種因素參與該過程的調(diào)節(jié)，細(xì)胞因子起重要作用，而TGF-β1是激活 HSC 的最重要促進(jìn)因子［3］。

TGFβ是一種多功能的多肽類細(xì)胞因子，幾乎體內(nèi)所有細(xì)胞都能分泌TGFβ并存在其受體，在細(xì)胞的生長調(diào)節(jié)中起重要作用。自從1983年TGFβ1及隨后其他兩個(gè)成員TGFβ2、TGFβ3在哺乳類動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，關(guān)于TGFβ的研究也越來越引起人們的重視。TGFβ家族是已知與纖維化形成關(guān)系最密切的細(xì)胞因子［4］，其中，TGFβ1是最重要的致纖維化因子［5］，在肝纖維化發(fā)展過程中起重要作用。TGFβ1是啟動(dòng)鄰近靜息態(tài)HSC激活和轉(zhuǎn)化的初始信號之一，Gressner［6］等在肝纖維化形成的3步激活模式中表明TGFβ1的這種初始激活作用，并已被大量研究證實(shí)。Kupper細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板的旁分泌及HSC的自分泌是TGFβ1早期持續(xù)增高并使肝纖維化持續(xù)發(fā)展的重要原因。TGFβ1所介導(dǎo)的信號通道被認(rèn)為在HSC的活化及ECM的產(chǎn)生起重要作用［7］。

HSC 作為肝纖維化發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)倍受關(guān)注，以HSC 為靶標(biāo)的治療措施逐漸成為抗纖維化的重要方法［8］。因此，構(gòu)建pcDNA3.1（+）-TGFβ1真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染HSC，建立高表達(dá)TGFβ1的HSC，模擬肝纖維化過程中TGFβ1高表達(dá)的體內(nèi)環(huán)境，并以此為細(xì)胞為基礎(chǔ)進(jìn)行下一步研究。本資料表明，pcDNA3.1（+）-TGFβ1真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，并可成功轉(zhuǎn)染HSC，轉(zhuǎn)染率為28.2%，48h后加入G418篩選，約21d可形成陽性克隆，經(jīng)熒光定量PCR及Western blot鑒定，克隆細(xì)胞高表達(dá)TGFβ1mRNA及蛋白，表明高表達(dá)TGFβ1的HSC篩選成功。鑒于HSC在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中的主導(dǎo)作用，可應(yīng)用高表達(dá)TGFβ1的HSC開展肝臟疾病，尤其是肝纖維化、肝硬化的研究，可得到更為可信且直接的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為肝纖維化的防治提供理論依據(jù)。