鄧雅楠，嚴俊鑫，楊慧穎,2，許凌欣

(1.東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.長春市南湖公園，吉林 長春 130000)

誘導(dǎo)抗性是植物遭受植食者侵害后出現(xiàn)的應(yīng)激反應(yīng)，直接影響害蟲取食行為、消化能力、落卵量、生殖力、發(fā)育速度以及被捕食比率等，間接抑制害蟲的存活率[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸(salicylic acid,SA)可顯著延長西花薊馬(Frankliniellaocidentalis)的發(fā)育時間，抑制蛹期體重，降低西花薊馬的生存適合度[4]。用水楊酸處理后的棉花(Gossypiumhirsutum)喂養(yǎng)棉蚜(Aphisgosspii)后，棉蚜體重以及產(chǎn)仔量下降，若蚜發(fā)育歷程受到抑制[5]。近些年來，水楊酸類物質(zhì)因為具有高效、方便、無毒無污染、無殘留等優(yōu)點，逐漸成為研究者關(guān)注的熱點[6]。水楊酸是一種簡單的酚類化合物，易于轉(zhuǎn)化為水楊酸甲酯(methyl salicylate,MeSA)，后者為其功能性類似物，是以SA和甲醇為原料進行酯化反應(yīng)而成的酯類化合物，作為一種用途廣泛的新型植物激素，在植物應(yīng)對脅迫過程中發(fā)揮信號分子作用，強化植物抗逆性以及誘導(dǎo)防御反應(yīng)發(fā)生[2,6-9]。經(jīng)SA及其功能性類似物處理后菜豆(Phaseolusvulgari)[10]、野生稻(Oryzarufipogon)[11]、楊樹(PopulusSimonii×PopulusPyramibalis)[12]、燕麥(Avenanuda)[13]、香蕉(Musaacuminatacoll)[14]、冬麥(Triticumaestivum)[15]、玉米(Zeamays)[16]、小麥[17]等植物相關(guān)酶活性增強，次生代謝物質(zhì)含量增加。單寧又被稱為植物多酚，是植物體內(nèi)常見的次生代謝物質(zhì)，可與害蟲體內(nèi)消化酶結(jié)合從而干擾害蟲對營養(yǎng)物質(zhì)的消化及吸收[18]；過氧化物酶(POD)、超氧化物岐化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)是植物體內(nèi)重要的保護酶類，通過反饋調(diào)節(jié)使植物體內(nèi)自由基保持正常水平從而提高自身抗蟲性[19-20]。多酚氧化酶(PPO)可催化酚類物質(zhì)氧化為醌，從而抑制害蟲消化能力，提高植物抗蟲性[21]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物中催化苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶，隨著PAL活性升高植物體內(nèi)眾多次生代謝物質(zhì)含量也隨之升高，進而提高自身抗蟲能力[22-23]。

東北玉簪(Hostaensata)又名劍葉玉簪，是我國北方地區(qū)園林應(yīng)用以及民間藥用常見的植物種類。在夏季常因蛞蝓(Agriolimaxagrestis)等食葉害蟲侵襲而使東北玉簪生長受到抑制。一直以來，人們主要通過噴灑農(nóng)藥進行害蟲防治，但農(nóng)藥的使用不僅降低了東北玉簪的藥用價值，還會對生態(tài)系統(tǒng)造成破壞，而植物誘導(dǎo)抗性的研究為解決這一問題提供了新思路[24]。因此本研究以北方常見植物東北玉簪為材料，通過環(huán)保型外源物質(zhì)MeSA進行誘導(dǎo)，從東北玉簪葉片單寧含量及抗蟲相關(guān)酶活性變化入手，探究MeSA對東北玉簪抗性的影響，為綠色防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與MeSA處理

以三年生東北玉簪(有走莖小型玉簪)苗為試驗材料，試驗在東北林業(yè)大學(xué)苗圃內(nèi)進行，于7月選取健康及長勢一致的東北玉簪苗進行試驗。

參考楊世勇等[2]、楊帆[4]、王燕芳[5]、嚴俊鑫等[23]的研究過程與結(jié)論，根據(jù)實際情況進行調(diào)整，確定本研究的濃度梯度以及取樣時間點[2,4-5,23]。MeSA(≥99%，Sigma-Aldrich)用無水乙醇和蒸餾水稀釋成濃度為0.01、0.1、1.0、1.5、2.0 mmol·L-1的溶液。以無水乙醇加蒸餾水為對照，采用噴霧法對東北玉簪植株進行均勻噴施，直至葉面有液滴落下為止。不同濃度處理的植株用塑料布遮蓋異地放置，分別于噴施MeSA后的第1、3、5、7、10、15天的同一時間采集東北玉簪葉片進行生化分析，每處理3個重復(fù)。

1.2 測定方法

1.2.1單寧含量測定 采用F-D法[25]，稱取葉片0.5 g、加50 mL蒸餾水、于60 ℃保溫箱中過夜，過濾取上清液加入40 mL 80 ℃蒸餾水、于80 ℃水域中浸提20 min，如此反復(fù)3次，最后定容至250 mL。取1 mL上清液，加入70 mL蒸餾水、5 mL F-D試劑及10 mL飽和Na2CO3溶液，定容至100 mL，充分搖勻，30 min后在680 nm波長下讀取光密度。單寧含量用mg·g-1表示。

1.2.2苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定[25]稱取葉片0.5 g，加5 mL預(yù)冷的巰基乙醇硼酸緩沖液、0.1 g聚乙烯比咯烷酮(PVPP)及少量石英砂研磨成勻漿，于10 000 g下離心10 min，上清液即為粗酶液。取粗酶液0.1 mL，加入0.02 mol·L-1的L-苯丙氨酸1 mL和0.1 mol·L-1的硼酸緩沖液(pH=8.8)2 mL，混勻后于290 nm處測起始吸光度值，將測定后的各管于30 ℃水浴中保溫30 min，再與290 nm處測定各管吸光度值。以每30 min吸光度值變化0.01所需酶量為1個酶活性單位，3次重復(fù)。

1.2.3多酚氧化酶(PPO)活性測定[25]稱取葉片0.5 g，加入0.05 mol·L-1磷酸緩沖液(pH=5.5)及少量石英砂研磨成勻漿，4 000 r·min-1離心15 min，上清液即為粗酶液。取粗酶液0.1 mL，加1.5 mL 0.1 mol·L-1鄰苯二酚，1.4 mL磷酸緩沖液，37 ℃反應(yīng)10 min。以磷酸緩沖液代替酶液作為對照(調(diào)零)，420 nm下測定吸光值。3次重復(fù)。

1.2.4過氧化物酶(POD)活性的測定 采用愈創(chuàng)木酚法[26-27]，稱取葉片0.5 g于預(yù)冷研缽中，加少量石英砂和0.05 mmol·L-1的磷酸緩沖液(pH=5.5)研磨成勻漿，4 ℃下4 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液。取待測酶液0.1 mL，加愈創(chuàng)木酚和H2O2各1.0 mL，磷酸緩沖液2.9 mL，在470 nm下記錄2 min內(nèi)吸光值的變化。3次重復(fù)。

1.2.5超氧化物歧化酶(SOD)活性測定 采用氮藍四唑(NBT)法[26-28]，粗提液的提取同POD。酶活性測定的反應(yīng)體系為：粗酶液0.05 mL，0.05 mol·L-1磷酸緩沖液(pH=7.8)1.5 mL，EDTA-NA2溶液、NBT溶液、Met溶液、核黃素溶液各0.03 mL，蒸餾水0.25 mL。將裝有上述試劑的試管置于4 000 lx熒光燈下進行顯色反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后以暗中對照管作空白(調(diào)零)，在560 nm處測定個管吸光度值。3次重復(fù)。

1.2.6過氧化氫酶(CAT)活性的測定 采用紫外分光光度計法[26]，稱取葉片0.5 g，加入0.2 mol·L-1磷酸緩沖液(pH=7.8)及少量石英砂研磨成勻漿，4 000 r·min-1離心15 min后上清液即為粗酶液。取粗酶液0.2 mL，加磷酸緩沖液1.5 mL，蒸餾水1.0 mL，25 ℃預(yù)熱后，逐管加入0.3 mL H2O2，加完后立即計時，在240 nm處測定吸光值。3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計平均值和標準誤差，對處理結(jié)果進行單因素差異顯著性分析，并用LSD法對各測定數(shù)據(jù)進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeSA處理對東北玉簪單寧含量的影響

MeSA處理后的東北玉簪葉片單寧含量有不同程度的升高(表1)。經(jīng)0.01 mmol·L-1MeSA處理后的單寧含量在第1、3、7天顯著高于對照(P<0.05)，在第3天達最大值,為對照的1.15倍，在第5、10、15天趨于對照(P>0.05)；經(jīng)0.1 mmol·L-1MeSA處理后的單寧含量在第1、7、10、15天顯著高于對照(P<0.05)，在第10天達最大值,為對照的1.27倍，在第3、5天雖高于對照但差異不顯著(P>0.05)；經(jīng)1.0 mmol·L-1MeSA處理后的單寧含量在第1、3、5天顯著高于對照(P<0.05)，在第5天達最大值,為對照的1.38倍，在第7、10、15天恢復(fù)對照水平(P>0.05)；經(jīng)1.5、2.0 mmol·L-1MeSA處理后的單寧含量在15天內(nèi)均顯著高于對照(P<0.05)，且均在第5天達最大值分別為對照的2.44、2.47倍。

2.2 MeSA處理對東北玉簪PAL活性誘導(dǎo)效應(yīng)

經(jīng)0.01 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性在第3、7天顯著高于對照(P<0.05)(表2)，在第3天達最大值為對照的1.18倍，在其余各時間點趨于對照水平(P>0.05)；經(jīng)0.1、1.0、1.5 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性在第1、3、5、7天顯著高于對照(P<0.05)，在第5天達最大值且分別為對照的1.62、1.67、1.89倍，在第10、15天均恢復(fù)對照水平(P>0.05)；經(jīng)2.0 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性在第15天內(nèi)雖高于對照但差異不顯著(P>0.05)。

表1 MeSA對東北玉簪單寧含量的影響Table 1 Effect on tannin content of Hosta ensata induced by MeSA mg·g-1

同列不同字母表示不同濃度間差異顯著(P<0.05)。下同。

Different lowercase letters in the same column indicate significant difference between different treatment concentr ations at the 0.05 level; similarly for the following tables.

表2 MeSA對東北玉簪PAL 活性的影響Table 2 Effect on PAL activity of Hosta ensata induced by MeSA U·(g·min)-1

2.3 MeSA處理對東北玉簪PPO活性誘導(dǎo)效應(yīng)

經(jīng)0.01 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性在第3、5、7天顯著高于對照(P<0.05)(表3)，在第3天達最大值,為對照的1.88倍，在第1、10、15天雖高于對照但差異不顯著(P>0.05)；經(jīng)0.1 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性在第3、5、7、10天顯著高于對照(P<0.05)，在第3天達最大值為對照的1.46倍，在第1、15天高于對照但差異不顯著(P>0.05)；經(jīng)1.0 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性在第3、5、10天顯著高于對照(P<0.05)，在第3天酶活性達最大值為對照的2.04倍，在第1、7、15天趨于對照水平(P>0.05)；經(jīng)1.5 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性在第3、7天顯著高于對照(P<0.05)，在第3天達最大值,為對照的1.36倍，在其余各時間點趨于對照水平(P>0.05)；經(jīng)2.0 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性僅在第7天顯著高于對照(P<0.05)，為對照的1.19倍，在其余各時間點均趨于對照水平(P>0.05)。

2.4 MeSA處理對東北玉簪POD活性誘導(dǎo)效應(yīng)

MeSA處理后的東北玉簪葉片POD活性呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(表4)。經(jīng)0.01 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性僅在第3天顯著高于對照(P<0.05)，為對照的1.29倍，在其余各時間點趨于對照水平(P>0.05)；經(jīng)0.1 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性在第3、5、7、10天顯著高于對照(P<0.05)，在第3天達最大值為對照的1.55倍，在第1、15天雖高于對照但差異不顯著(P>0.05)；經(jīng)1.0 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性在第1、3、5、7、10天顯著高于對照(P<0.05)，在第3天達最大值,為對照的1.59倍，在第15天略低于對照但差異不顯著(P>0.05)；經(jīng)1.5 mmol·L-1MeSA處理后酶活性在第1、3、7天顯著高于對照(P<0.05)，在第3天達最大值為對照的1.32倍，在第5、10、15天趨于對照水平(P>0.05)；經(jīng)2.0 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性僅第7天顯著高于對照(P<0.05)，為對照的1.06倍，在其余各時間點趨于對照水平(P>0.05)。

2.5 MeSA處理對東北玉簪SOD活性誘導(dǎo)效應(yīng)

MeSA處理后的東北玉簪葉片SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(表5)。經(jīng)0.01 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性在第3、5、7天顯著高于對照(P<0.05)，在第3天達最大值,為對照的1.37倍，在第1、10、15天雖高于對照但差異不顯著(P>0.05)；經(jīng)0.1 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性在第1、3、5、7天顯著高于對照(P<0.05)，在第3天達最大值,為對照的1.71倍，在第10、15天趨于對照水平(P>0.05)；經(jīng)1.0、1.5 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性在第1、3、5、7、10天顯著高于對照(P<0.05)，在第3天達最大值,分別為對照的1.77、1.70倍，在第15天略低于對照但差異不顯著(P>0.05)；經(jīng)2.0 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性在第3、5、7、10天顯著高于對照(P<0.05)，在第3天達最大值,為對照的1.44倍，在第1、15天雖高于對照但差異不顯著(P>0.05)。

表3 MeSA對東北玉簪PPO 活性的影響Table 3 Effect on PPO activity of Hosta ensata induced by MeSA U·(g·min)-1

表4 MeSA對東北玉簪POD 活性的影響Table 4 Effect on POD activity of Hosta ensata induced by MeSA U·(g·min)-1

表5 MeSA對東北玉簪SOD 活性的影響Table 5 Effect on SOD activity of Hosta ensata induced by MeSA U·g-1

2.6 MeSA處理對東北玉簪CAT活性誘導(dǎo)效應(yīng)

經(jīng)0.01 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性在第3、5、7天顯著高于對照(P<0.05)(表6)，在第3天達最大值,為對照的1.25倍，在第1、10、15天趨于對照水平(P>0.05)；經(jīng)0.1 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性在第3、5、7天顯著高于對照(P<0.05)，在第5天達最大值,為對照的1.61倍，在第1、10、15天趨于對照水平(P>0.05)；經(jīng)1、1.5mmol·L-1MeSA處理后的酶活性在第1、3、5、7天顯著高于對照(P<0.05)，在第5天達最大值,分別為對照的1.64、1.90倍，第10、15天恢復(fù)對照水平(P>0.05)；經(jīng)2 mmol·L-1MeSA處理后的酶活性在第5、7天顯著高于對照(P<0.05)，在第5天達最大值,為對照的1.17倍，在其余各時間點均趨于對照水平(P>0.05)。

表6 MeSA對東北玉簪CAT 活性的影響Table 6 Effect on CAT activity of Hosta ensata induced by MeSA U·(g·min)-1

3 討論

水楊酸類物質(zhì)作為植物應(yīng)對脅迫時的重要信號分子，能誘導(dǎo)多種植物產(chǎn)生持續(xù)抗性，激發(fā)植物體內(nèi)PAL、PPO、POD等酶活性的表達[5]。研究表明，MeSA熏蒸后的合作楊(Populussimonii×P.pyramidalis‘Opera 8277’)葉片內(nèi)PAL、PPO、POD活性升高，經(jīng)SA處理后的棉花葉片PAL、PPO呈先升高后降低趨勢[5,29]。本研究結(jié)果表明，不同濃度的MeJA能誘導(dǎo)東北玉簪葉片PAL、PPO、POD活性增加，基本呈先升高后降低趨勢，這與前人的研究結(jié)果一致。經(jīng)SA誘導(dǎo)后，重瓣玫瑰(Rosarugosa‘Plena’)葉片PAL、PPO、POD活性呈先升高后降低趨勢，當SA濃度為1.0、1.5、1.0 mmol·L-1時，PAL、PPO、POD活性分別在第3、3、5天達到最大值，且持效期分別為第9、7、7天[30]。本研究中，當MeSA濃度為1.5、1.0、1.0 mmol·L-1時，PAL、PPO、POD活性分別在第5、3、3天達到最大值，且持效期分別為7、10、10天。這些研究結(jié)果與嚴俊鑫等[30]的研究結(jié)果在變化趨勢上相一致，但在誘導(dǎo)的最適劑量、誘導(dǎo)后酶活性出現(xiàn)峰值的時間以及持效期上有所差異，這可能是由于不同植物種類對SA類物質(zhì)的防御反應(yīng)存在差異性。

水楊酸類物質(zhì)作為植物體內(nèi)信號分子可通過調(diào)控H2O2降解酶的活性而累積H2O2，H2O2作為第二信使可誘導(dǎo)SOD的合成來提高植物對逆境的抵抗能力[31]。在對野生稻的研究中發(fā)現(xiàn)，2.5×10-5mol·L-1MeSA可使SOD活性在36 h時上升到最高隨后略有回落[12]；2.0 mmol·L-1SA處理后的水稻(Oryzasativa)葉片內(nèi)SOD活性表現(xiàn)為先升高后降低，在第3天達到峰值[32]。本研究表明，經(jīng)MeSA處理后的東北玉簪葉片內(nèi)SOD活性呈先升高后降低趨勢，濃度為1.0 mmol·L-1MeSA對SOD活性誘導(dǎo)效果最佳，在第3天使其達到峰值，持效期約為10 d。這些結(jié)果在變化趨勢和誘導(dǎo)后酶活性出現(xiàn)峰值的時間上與在野生稻和水稻上的研究結(jié)果相類似，但最適濃度以及持效期略有差異，這除了與植物種類間防御反應(yīng)差異性有關(guān)外，可能還與外源物質(zhì)濃度梯度和取樣時間點的選取有關(guān)。CAT作為H2O2降解酶，可清除細胞內(nèi)多于的H2O2，在維持細胞內(nèi)過氧化物動態(tài)平衡過程中與SOD和POD共同發(fā)揮重要作用，因此多數(shù)學(xué)者認為水楊酸類物質(zhì)在誘導(dǎo)SOD合成的過程中調(diào)控的H2O2降解酶即為CAT，也就是說水楊酸類物質(zhì)通過抑制CAT活性，提高植物細胞內(nèi)H2O2含量，從而達到提高SOD活性的目的[6]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MeSA處理后東北玉簪葉片內(nèi)CAT活性基本呈先升高后降低趨勢，濃度為1.5 mmol·L-1MeSA對CAT活性誘導(dǎo)效果最佳，在第5天使其達到峰值，持效期約為7 d。這一變化趨勢與多數(shù)學(xué)者的觀點并不一致，但卻與張穎等[33]對蘋果(Maluspumila)葉片CAT活性研究結(jié)果相類似。由此推測本研究中CAT活性的升高可能是由于MeSA誘導(dǎo)了東北玉簪葉片的氧猝發(fā)，而第7天后CAT活性降低趨于對照水平可能是隨著時間的延長氧猝發(fā)逐漸減弱造成的。單寧作為植物體內(nèi)關(guān)鍵防御物質(zhì)之一，可通過與蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合從而影響昆蟲的取食、消化等[23]。對黃瓜(Cucumissativus)的試驗中發(fā)現(xiàn)，SA對黃瓜葉片內(nèi)單寧含量誘導(dǎo)效果不明顯，處理后的葉片內(nèi)單寧含量略有升高，但與對照相比均差異不顯著[4]。而本研究所使用的5種濃度的MeSA均引起了東北玉簪葉片內(nèi)的單寧含量顯著升高，濃度為2.0 mmol·L-1MeSA對單寧誘導(dǎo)效果最佳，在第5天使其達到峰值，持效期約為15 d。這些結(jié)果與楊帆[4]對黃瓜的研究結(jié)果不同，但與王燕芳[5]的研究結(jié)果類似，只是最適濃度、峰值出現(xiàn)的時間以及持效期有較大差異，可能是不同植物對MeSA應(yīng)激反應(yīng)不同。

4 結(jié)論

本研究使用不同濃度的MeSA對東北玉簪進行處理，得出適宜濃度的MeSA可以提高東北玉簪抗蟲相關(guān)酶活性及次生代謝物質(zhì)含量的結(jié)論，研究結(jié)果認為1.0 mmol·L-1MeSA對PPO、POD、SOD活性誘導(dǎo)效果較好，1.5 mmol·L-1MeSA對PAL、CAT活性誘導(dǎo)效果較好，而2.0 mmol·L-1MeSA對單寧含量誘導(dǎo)效果較好。MeSA對觀賞植物抗逆性的調(diào)控較為復(fù)雜，若要以綠色防控完全取代傳統(tǒng)防治措施還需要進行更為深入的探討。