韓蘊琦，柴鴻勛，馬召穩(wěn)，王占彬，李 旺

(河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽 471023)

蛋白桑(Morusalba)也叫飼料桑，桑屬(Morus)，是由全國各地收集的28個桑樹品種經過長期選擇與改良，雜交優(yōu)化而得的新品系，可作動物飼料和蔬菜，其蛋白質含量較高，葉片蛋白質含量可達36%[1]。歷代中醫(yī)藥書籍中有關于桑葉治療消渴癥的記載，《本草綱目》中有“汁煎代茗，能止消渴”的記載[2]。桑樹中存在多種生物活性成分，其中多種生物堿活性成分均有降血糖的作用，但是在降血糖過程中起主要作用的是一種名為1-脫氧野尻霉素的多羥基生物堿[3-5]。

1-脫氧野尻霉素的化學名稱為3，4，5-三羥基-2-羥甲基四氫吡啶，英文名稱為1-Deoxynojirimycin，簡稱1-DNJ或者DNJ，分子式為C6H13NO4[6]。DNJ能夠抑制α-糖苷酶的活性，通過降低小腸對糖類物質的分解和吸收，同時能夠促進胰島素分泌，從而達到降低血糖的作用，是一種治療糖尿病的有效藥物[7-9]。而且，1-脫氧野尻霉素還具有抗病毒[10]、抑制腫瘤轉移[11]、降血壓[12]、降血脂[13]等功效，具有很高的食用和藥用價值。

桑葉中DNJ含量的測定常采用高效液相色譜法，根據是否需要衍生化，高效液相色譜法可以分為不需要柱前衍生化和需要柱前衍生化兩種方法，本研究采用柱前衍生化高效液相色譜熒光檢測法進行檢測，該方法具有操作簡單、靈敏度好、準確度高、衍生化反應速度快、反應產物穩(wěn)定等優(yōu)點[14]。

DNJ的提取量除了與桑葉中DNJ含量有關之外，還與提取方法和桑葉處理方式有一定關系。本研究探討不同提取方法以及不同的干燥溫度對于DNJ提取量的影響，從而選擇更好的提取方法和干燥溫度，提高DNJ的提取量和蛋白桑資源的利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋白桑采自河南汝州市河南宏翔生物科技有限公司蛋白桑種植基地。

DNJ標準品來自Sigma公司，F(xiàn)MOC-Cl來自上海譜振生物科技有限公司，乙腈來自默克公司，其他試劑均為分析純，試驗用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀熒光檢測器(美國Waters公司)，臺式冷凍高速離心機(美國Thermo Fisher公司)，電熱恒溫水浴箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1蛋白桑樣品處理 采集1.3 m左右的新鮮蛋白桑，切短后分別采用自然曬干，鼓風干燥箱中分別于70、80、90和100 ℃條件下烘干至恒重后，粉碎過0.9 mm篩，所制樣品分別標號1、2、3、4、5號，備用。

1.3.2DNJ的提取 樣品分別采用鹽酸提取法、水提取法和乙醇提取法3種方法進行提取。

鹽酸提取法：準確稱取蛋白桑粉0.2 g放置于5 mL離心管，加入0.05 mol·L-1鹽酸溶液3 mL，渦旋提取30 s，10 000 r·min-1高速離心15 min，取上清液，殘渣再加入0.05 mol·L-1鹽酸溶液重復提取一次，合并兩次提取液，加蒸餾水定容至50 mL，備用。

水提取法：準確稱取蛋白桑粉0.5 g放置于50 mL離心管，加入適量超純水，80 ℃水浴浸提兩次，每次2 h，高速離心后取上清液，合并兩次提取液，加超純水定容至100 mL，備用。

乙醇提取法：準確稱取蛋白桑粉0.5 g放置于圓底燒瓶，加入一定量的70%乙醇，加熱回流提取兩次，每次2 h，合并兩次濾液定容至100 mL，備用。

1.3.3樣品DNJ含量的測定

DNJ的衍生化[15]：取提取液10 μL置于1.5 mL離心管，加入10 μL硼酸鹽緩沖液(pH=8.5)混合，再加入5 mmol·L-1的 FMOC-Cl乙腈混合液20 μL，均勻混合后于20 ℃水浴條件下反應20 min，然后加入0.1 mol·L-1甘氨酸10 μL與剩余的衍生化試劑反應，終止反應。最后，加入0.1%的醋酸水溶液950 μL稀釋，混合均勻后用0.45 μm的一次性無菌針頭過濾器過濾，取10 μL進行進樣分析。

高效液相色譜條件:色譜柱為C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為0.1%醋酸-乙腈(45∶55，V∶V)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為25 ℃；熒光檢測器激發(fā)波長254 nm，發(fā)射波長322 nm，進樣量10 μL。

繪制標準曲線：準確稱取3.4 mg的DNJ標準品定容于100 mL蒸餾水中，制得標準品母液，吸取不同體積的標準品母液配制成不同濃度的DNJ標準溶液。吸取不同濃度的標準液進行衍生化和液相色譜分析，結果以標準品溶液濃度(X)為橫坐標，色譜峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.4數(shù)據統(tǒng)計與分析 每個樣品重復測定3次，所得試驗數(shù)據采用Excel 2007進行記錄和收集，用SPSS 22分別對相同提取方法不同干燥條件和相同干燥條件不同提取方法進行單因素方差分析，并用Duncan法對各測定數(shù)據進行多重比較，結果均采用“平均值±標準誤”表示，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 DNJ標準曲線的繪制

按照1.3.3的方法和色譜條件下，得到DNJ標準品色譜圖和不同提取法提取的蛋白桑DNJ樣品色譜圖(圖1)。以標準品溶液濃度(X)為橫坐標，色譜峰面積(Y)為縱坐標，可以得到相關的回歸方程：

Y=2 568 867X+743 351，R2=0.999 3。

方程表明,在0.34～17 μg·mL-1范圍內具有良好的線性關系。

圖1 不同方法提取的DNJ樣品高效液相色譜圖Fig. 1 High-performance liquid chromatogram of DNJ extracted from Morus alba by different methods

A.DNJ標準品色譜圖 Standard chromatogram of DNJ; B,蛋白桑樣品色譜圖 Chromatogram of DNJ inMorusalba; a,水提取法 Water extraction method; b,乙醇提取法 Ethanol extraction method; c,鹽酸提取法 Hydrochloric acid extraction method.

2.2 不同干燥溫度對鹽酸提取法DNJ提取量的影響

鹽酸提取法在不同干燥溫度下DNJ提取量由高到低為90 ℃>80 ℃>100 ℃>70 ℃>曬干(表1)。在溫度低于90 ℃時，隨著溫度升高，DNJ的提取量增加；溫度高于90 ℃后， DNJ的提取量下降。90 ℃干燥樣品DNJ提取量最高，為3.38 mg·g-1，顯著高于其他干燥條件下的DNJ提取量(P<0.05)。曬干條件下的DNJ提取量最低，為1.27 mg·g-1，顯著低于其他干燥條件下的DNJ提取量(P<0.05)。70 ℃和80 ℃干燥條件下的DNJ提取量與100 ℃相比DNJ提取量均沒有顯著差異(P>0.05)。

90 ℃干燥樣品比80 ℃干燥樣品DNJ提取量高約7.0%，比100 ℃干燥樣品DNJ提取量高約8.3%，比70 ℃干燥樣品DNJ提取量高約10.8%，比曬干樣品DNJ提取量高約166.1%。這表明，鹽酸提取法提取DNJ時，桑葉的最佳干燥溫度為90 ℃。

2.3 不同干燥溫度對水提取法DNJ提取量的影響

水提取法在不同干燥溫度下DNJ提取量由高到低為80 ℃>100 ℃>90 ℃>70 ℃>曬干(表1)。80 ℃干燥樣品的DNJ提取量最高，為1.91 mg·g-1，顯著高于其他干燥條件的DNJ提取量(P<0.05)。曬干樣品的DNJ提取量最低，為0.89 mg·g-1，顯著低于其他干燥條件下的DNJ提取量(P<0.05)。而且，不同干燥條件下，DNJ提取量均有顯著差異(P<0.05)。

80 ℃干燥樣品比100 ℃干燥樣品DNJ提取量高約15.8%，比90 ℃干燥樣品DNJ提取量高約24.8%，比70 ℃干燥樣品DNJ提取量高約56.6%，比曬干樣品DNJ提取量高約114.6%。這表明，水提取法提取DNJ時，桑葉的最佳干燥溫度為80 ℃。

2.4 不同干燥溫度對乙醇提取法DNJ提取量的影響

乙醇提取法在不同干燥溫度下DNJ提取量由高到低為100 ℃>90 ℃>80 ℃>70 ℃>曬干(表1)?？梢钥闯觯S著溫度的升高，DNJ的提取量也隨之增加。100 ℃干燥樣品的DNJ提取量最高，為3.77 mg·g-1，顯著高于其他干燥條件的DNJ提取量(P<0.05)。曬干樣品的DNJ提取量最低，為1.35 mg·g-1，顯著低于其他干燥條件的DNJ提取量(P<0.05)。70和80 ℃干燥條件下的DNJ提取量沒有顯著差異(P>0.05)。

100 ℃干燥樣品比90 ℃干燥樣品DNJ提取量高約8.0%，比80 ℃干燥樣品DNJ提取量高約16.7%，比70 ℃干燥樣品DNJ提取量高約19.3%，比曬干樣品DNJ提取量高約179.3%。這表明，乙醇提取法提取DNJ時，桑葉的最佳干燥溫度為100 ℃。

2.5 不同提取方法對DNJ提取量的影響

在曬干、80 ℃和90 ℃干燥條件下，水提取法的DNJ提取量最低，分別為0.89、1.91和1.53 mg·g-1，均顯著低于鹽酸提取法和乙醇提取法的DNJ提取量(P<0.05)，鹽酸提取法和乙醇提取法的DNJ提取量無顯著差異(P>0.05)。在70 ℃和100 ℃干燥條件下，水提取法的DNJ提取量分別為1.22和1.65 mg·g-1，均顯著低于鹽酸提取法和乙醇提取法的DNJ提取量(P<0.05)；乙醇提取法的DNJ提取量分別為3.16和3.77 mg·g-1，均顯著高于水提取法和鹽酸提取法的DNJ提取量(P<0.05)(表1)。總體來說，乙醇提取法的DNJ提取量最高，鹽酸提取法的DNJ提取量較高，水提取法的DNJ提取量最低。

表1 干燥條件和提取方法對DNJ提取量的影響Table 1 Effect of different extraction methods on the amount of DNJ extracted under the different drying conditions mg·g-1

同行不同大寫字母表示不同干燥處理間差異顯著(P<0.05)，同列不同小寫字母表示不同提取方法之間差異顯著(P<0.05)。

Different cappital letters indicate significant difference between the different drying conditions at the 0.05 level, different lowercase letters indicate significant difference between the different extration methods at the 0.05 level; similarly for the following tables.

3 討論

3.1 DNJ的提取方法

DNJ提取的方法很多，常用的有水提取法、鹽酸提取法、乙醇提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、真空氣流細胞破壁技術(VAPB)輔助提取法等。同一種提取方法對不同部位和不同處理方式的桑產品DNJ提取量不盡相同。同一提取方法，提取工藝和提取過程中的輔助方法也會對提取結果產生顯著影響。曾銳等[16]用水煎煮提取桑粉中的DNJ，用HPLC-ELSD法測定了桑樹不同部位中的DNJ含量，結果發(fā)現(xiàn)不同品種桑的不同部位中DNJ含量差異較大。姜永濤等[17]用去離子水提取桑葉中的DNJ后，測定了不同品種桑葉中的DNJ含量，結果發(fā)現(xiàn)不同品種桑葉中DNJ含量差異較大。肖洪等[18]用超純水對發(fā)酵的桑葉粉進行加熱浸提，通過測定DNJ等活性成分的含量發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵方式DNJ提取含量差異顯著。胡瑞君和車振明[19]使用水提法時，以微波處理作為輔助條件，優(yōu)化了微波處理工藝，提高了提取量。鄭曉靜等[20]使用水提法時，以超聲波處理作為輔助條件，優(yōu)化了超聲波提取條件，提高了DNJ的提取量。本研究采用水提取法探究了不同干燥溫度對蛋白桑中DNJ提取量的影響，結果發(fā)現(xiàn)蛋白桑經過不同溫度干燥后，DNJ提取量有較大的差異。

化學試劑作為提取劑的應用，豐富了DNJ的提取方法，提高了提取量。目前，DNJ的化學試劑提取法多為酸提法和醇提法。劉凡等[21]用0.05 mol·L-1的鹽酸溶液提取桑葉粉中的DNJ，對98份不同桑樹品種資源的桑葉中1-脫氧野尻霉素進行提取，獲得了較高的提取量。劉偉鋆等[22]用70%的乙醇提取桑葉中的DNJ，提取液經過純化后，得到DNJ含量為23.2%。本研究發(fā)現(xiàn)，酸提取法和醇提取法對相同樣品的DNJ提取量顯著高于水提取法，說明未來提取方法的發(fā)展方向應以化學試劑提取為主。

3.2 干燥條件對DNJ含量的影響

DNJ的提取量受眾多因素影響，如干燥方式、提取方法、處理方法等，其中干燥環(huán)節(jié)的影響尤其明顯，而且不同的干燥方式和干燥溫度也能夠影響桑葉中DNJ的提取量。秦櫻瑞等[23]分別用熱風干燥、微波干燥、冷凍干燥、真空干燥4種干燥方法對桑葉進行干燥處理，用超純水提取后測定DNJ含量，結果發(fā)現(xiàn)微波干燥的桑葉DNJ含量最高，熱風干燥的桑葉DNJ含量較高，冷凍干燥的桑葉DNJ含量較低，真空干燥的桑葉DNJ含量最低。劉紅英等[24]分別用不同的方法對桑白皮進行干燥，用鹽酸溶液作為溶劑超聲提取后，測定DNJ含量，結果發(fā)現(xiàn)烘干樣品中DNJ含量最高，曬干樣品DNJ含量次之，陰干樣品DNJ含量最低。本研究在這些研究基礎上，對烘干的最佳溫度進行了研究，發(fā)現(xiàn)不同提取方法最佳烘干溫度不盡相同，豐富了蛋白桑最佳烘干溫度和提取方法的配套數(shù)據。

4 結論

本研究結果表明，采用鹽酸提取法時，蛋白桑最佳干燥溫度為90 ℃，DNJ提取量為3.38 mg·g-1；采用水提取法時，蛋白桑最佳干燥溫度為80 ℃，DNJ提取量為1.91 mg·g-1；采用乙醇提取法時，蛋白桑最佳干燥溫度為100 ℃，DNJ提取量為3.77 mg·g-1；干燥條件相同時，乙醇提取法的DNJ提取量最高，鹽酸提取法的DNJ提取量較高，水提取法的DNJ提取量最低。