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        金線蓮不同繁殖途徑比較

        2018-09-19 07:37:42黎倩蕓葉志聰曾宋君吳坤林
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年26期
        關(guān)鍵詞:莖段金線外植體

        鄭 楓,黎倩蕓,葉志聰,曾宋君,吳坤林*

        (1.中國(guó)科學(xué)院華南植物園,廣東廣州 510650;2.廣州甘潤(rùn)堂生物科技有限公司,廣東廣州 510900)

        金線蓮[Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl]即金線蘭,別名金線入骨消、鳥人參等,是蘭科開(kāi)唇蘭屬的一種多年生珍稀藥用草本植物,有清熱涼血、滋陰降火、消炎止痛之功效,民間多用于小兒高燒不退、驚風(fēng),現(xiàn)也被應(yīng)用于糖尿病、癌癥等疑難病癥的治療。金線蓮對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較苛刻[1],且種子發(fā)育不完全,自然狀態(tài)下極難萌發(fā),通過(guò)分根法或扦插法繁殖系數(shù)極低,加上近年來(lái)生態(tài)環(huán)境日益惡化和藥農(nóng)過(guò)度采挖,金線蓮的野生蘊(yùn)藏量日益稀少。

        植物組織培養(yǎng)技術(shù)是種苗繁育的有效手段。從20世紀(jì)90年代起,關(guān)于金線蓮的組織培養(yǎng)技術(shù)就已有報(bào)道,主要是對(duì)單一繁殖途徑的外植體選擇[2-3]、培養(yǎng)基類型[4]、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度[5]、工廠化育苗技術(shù)[6]以及移栽[7-9]等方面進(jìn)行研究,針對(duì)不同繁殖途徑的比較研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者對(duì)金線蓮組織培養(yǎng)中種子的非共生萌發(fā)和以莖段為外植體建立的無(wú)性克隆方法這2種繁殖途徑進(jìn)行比較分析,篩選出穩(wěn)定、高效的組培繁育體系,以期為專業(yè)化、規(guī)模化種苗繁育提供技術(shù)指導(dǎo)。

        1 材料與方法

        1.1材料以野生金線蓮的莖段和對(duì)其人工授粉獲得的成熟蒴果為外植體。野生金線蓮于2015年8月采自廣東省廣州市從化區(qū)天湖。

        1.2方法

        1.2.1外植體的消毒。

        1.2.1.1以野生金線蓮的莖段為外植體。取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲害的野生金線蓮全株,用軟毛刷在流水下將苗株表面小心洗凈,去掉根、葉片和葉鞘,頂部未展開(kāi)葉片可保留約1 cm。用洗衣粉水浸泡,同時(shí)輕輕搖動(dòng)約10 min,清水洗凈后拿至超凈工作臺(tái)。將金線蓮莖條切成2 cm左右?guī)Ч?jié)莖段,先用75%乙醇浸泡30 s,在0.1% HgCl2中分別浸泡并搖動(dòng)5、8、10、13、16 min,無(wú)菌水沖洗3~5次,無(wú)菌紙吸干莖段表面水分,切去兩端各1~2 mm,接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每個(gè)處理接種15瓶,每瓶接種1個(gè)莖段。培養(yǎng)40 d時(shí)觀察生長(zhǎng)情況,統(tǒng)計(jì)其污染率、成功率和誘導(dǎo)率。

        1.2.1.2以野生金線蓮的成熟蒴果為外植體。取野生金線蓮的成熟蒴果,流水下洗凈后,浸泡在洗衣粉水中并輕輕搖動(dòng)約10 min,清水洗凈后拿至超凈工作臺(tái)。75%乙醇浸泡30 s,再在0.1% HgCl2中浸泡并搖動(dòng)15 min,無(wú)菌水沖洗3~5次后,用無(wú)菌紙吸干蒴果表面水分,切開(kāi)后將內(nèi)部種子均勻撒在播種培養(yǎng)基表面。30 d時(shí)統(tǒng)計(jì)存活情況。

        1.2.2無(wú)菌繁殖系的建立。將無(wú)菌存活的莖段外植體接種到以MS為基本培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基1~4中;將無(wú)菌存活的種子接種到以1/2MS為基本培養(yǎng)基的播種培養(yǎng)基5~9中。

        1.2.3增殖培養(yǎng)。將莖段外植體誘導(dǎo)出的簇生不定芽進(jìn)行分切,轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基10~13中,增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基,添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA不同濃度的組合。

        1.2.4生根培養(yǎng)。將增殖苗瓶中高度3 cm以上、葉片張開(kāi)2片以上、莖粗壯的金線蓮苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基14中。種子苗生長(zhǎng)到2~3 cm高時(shí)轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基15中。

        1.2.5培養(yǎng)條件。培養(yǎng)溫度(23±2)℃,光照強(qiáng)度1 000~1 500 lx,光照時(shí)間12 h/d。

        1.2.6培養(yǎng)基配制。不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基1~4:MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 2.0~5.0 mg/L;播種培養(yǎng)基5~9:以1/2MS為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度的6-BA(0、0.5 mg/L)和NAA(0、0.3、0.4、0.5、1.0 mg/L);增殖培養(yǎng)基10~13:MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 2.0~5.0 mg/L+蛋白胨3.0 g/L;生根培養(yǎng)基14:MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 5.0 mg/L+蛋白胨3.0 g/L+活性炭3.0 g/L;壯苗培養(yǎng)基15:MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蛋白胨3.0 g/L+活性炭2.0 g/L。每種培養(yǎng)基中均添加白糖30 g/L、卡拉膠7.2 g/L,調(diào)節(jié)pH為5.4。

        1.2.7煉苗移栽。金線蓮生根苗生長(zhǎng)到高度7~8 cm、葉3片以上、根2條以上時(shí),將其擺放在種植大棚內(nèi)煉苗7~10 d,以適應(yīng)外界環(huán)境。將生根苗從培養(yǎng)瓶中取出,用清水洗凈,并用多菌靈、百菌清等殺菌藥浸泡10 min?;|(zhì)選用泥炭土∶珍珠巖=3∶1;分別以1、2、3株苗為一叢進(jìn)行種植,苗叢間隔3 cm。將2種繁殖途徑獲得的生根苗分別進(jìn)行移栽,每種密度種植3個(gè)托盤,每個(gè)托盤種植54穴,放置到大棚相同位置進(jìn)行養(yǎng)護(hù)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1外植體消毒效果比較由表1可知,隨著0.1%HgCl2消毒時(shí)間的加長(zhǎng),莖段外植體的污染率下降,而死亡率上升。同時(shí)也觀察到金線蓮越下端的莖段,污染率越高,尤其是長(zhǎng)有根的莖段,消毒成功率極低;近頂芽的莖節(jié)污染率較低,但是隨HgCl2消毒時(shí)間延長(zhǎng),莖節(jié)處縊縮死亡明顯增多。金線蓮莖段外植體最佳消毒方法為預(yù)處理→75%乙醇30 s→ 0.1%HgCl210 min →無(wú)菌水沖洗3~5次,消毒成功率可以達(dá)66.7%。金線蓮蒴果消毒后播種120瓶,成功105瓶,成功率為87.5%。從消毒效果來(lái)看,蒴果的消毒比莖段更方便、高效。

        表1HgCl2消毒時(shí)間對(duì)金線蓮莖段外植體消毒成功率的影響

        Table1EffectofHgCl2disinfectiontimeondisinfectionsuccessrateofexplantsofA.roxburghii

        消毒時(shí)間Disinfection timemin污染率Contamination rate∥%死亡率Mortality rate∥%成功率Success rate∥%5100.000873.3026.71026.76.766.71326.733.340.01620.073.36.7

        2.2無(wú)菌繁殖系建立比較金線蓮莖段外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d,莖節(jié)處腋芽萌動(dòng),出現(xiàn)乳白色凸起(圖1A);培養(yǎng)40 d時(shí),凸起處生長(zhǎng)為新芽(圖1B);培養(yǎng)70 d時(shí)大部分莖段能誘導(dǎo)出健壯的簇狀叢生芽(圖1C)。由表2可知,培養(yǎng)基4中不定芽發(fā)生效率最高,40 d時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)90%;莖尖伸長(zhǎng)生長(zhǎng)明顯,其下端莖節(jié)處易發(fā)生膨大,并生長(zhǎng)出數(shù)個(gè)不定芽;中間莖段較易發(fā)生簇狀不定芽。

        注:A.莖段外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d,莖節(jié)處發(fā)生乳白色凸起;B.莖段外植體莖節(jié)誘導(dǎo)培養(yǎng)40 d,凸起處生長(zhǎng)的新芽;C.莖段外植體誘導(dǎo)出的簇狀叢生芽;D.叢生芽穩(wěn)定增殖;E.無(wú)性克隆繁殖途徑生根苗Note:A.A white outgrowth started to develop from stem nodules after being induced from stem explants for 10 days;B.New buds growing at the outgrowths after being induced from stem explants for 40 days;C.Shoot clusters were induced from stem explants;D.Shoot clusters propagated efficiently;E.Plantlets were generated from plant cloning system圖1 金線蓮無(wú)性克隆繁殖途徑Fig.1 Asexual cloning propagation pathway of A. roxburghii

        Table2Effectsofdifferentconcentrationsof6-BAoninductionofclusteredshootsfromstemsegments

        金線蓮種子在1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)30~40 d時(shí)均能萌發(fā)形成淡黃色原球莖;后逐漸長(zhǎng)出絲狀白色表皮毛(圖2A),并分化出莖尖;培養(yǎng)70 d時(shí),可形成基部具表皮、毛頂部為莖尖的根狀莖(圖2B);培養(yǎng)150 d時(shí)才形成根莖葉俱全的小植株(圖2C)。培養(yǎng)基中添加少量的NAA、6-BA可提高種子萌發(fā)率(表3)。

        從發(fā)生方式、發(fā)生時(shí)間和生長(zhǎng)情況上比較,2種繁殖途徑建立無(wú)菌繁殖系的方式存在明顯差異。莖段外植體能更快完成誘導(dǎo),不定芽主要發(fā)生在莖節(jié)上,最早10 d左右便能觀察到萌動(dòng),且芽體健壯;大部分金線蓮種子培養(yǎng)30 d時(shí)在各播種培養(yǎng)基中均能萌發(fā),但需培養(yǎng)150 d才能形成根莖葉俱全的繁殖系。總體看來(lái),莖段外植體的誘導(dǎo)效率高,且叢生芽芽體健壯,所建立的無(wú)菌繁殖系明顯優(yōu)于種子無(wú)菌播種形成的繁殖系。

        注:A.種子萌發(fā)生長(zhǎng)出表皮毛;B.播種70 d時(shí)苗況;C.播種150 d時(shí)苗況;D.播種240 d時(shí)苗況;E.種子萌發(fā)生長(zhǎng)出的白化苗;F.種子非共生萌發(fā)繁殖途徑生根苗Note:A.Formation of ectopic trichome during seed germination;B.Seedlings after sowing for 70 days;C.Seedlings after sowing for 150 days;D.Seedlings after sowing for 240 days;E.Formation of albino seedling during seed germination;F.Seedlings were generated from non-asymbiotic germination圖2 金線蓮種子非共生萌發(fā)繁殖途徑Fig.2 Non-symbiotic germination propagation pathway of A. roxburghii seeds

        Table3Effectsofdifferentconcentrationsof6-BAandNAAonseedgerminationofA.roxburghii

        培養(yǎng)基編號(hào)Medium No.6-BA濃度Concentration of 6-BA∥mg/LNAA濃度Concentration of NAA∥mg/L萌發(fā)率 Germination rate∥%50085.3 a600.385.2 b700.495.8 b800.594.1 b90.51.093.5 b

        注:同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

        Note:Different small letters within the same column mean significant differences(P< 0.05)

        2.3增殖及壯苗培養(yǎng)比較在培養(yǎng)基4中誘導(dǎo)出的叢生芽,繼續(xù)培養(yǎng)則發(fā)生的新芽數(shù)多且小、節(jié)間變短、葉片變小,而在培養(yǎng)基2中,新芽健壯,且能夠穩(wěn)定增殖(圖1D),更加適宜叢生芽的增殖培養(yǎng)。

        培養(yǎng)150 d時(shí),種子苗莖部在壯苗培養(yǎng)基表面匍匐生長(zhǎng)2~4個(gè)莖節(jié),長(zhǎng)出1~4條根,綠色葉片逐漸長(zhǎng)大、出現(xiàn)葉紋(圖2C);培養(yǎng)240 d時(shí),小苗的莖變得更粗壯,葉片及莖逐漸由綠色或淺黃色變成紅棕色,且金線清晰,苗平均高度4 cm,莖直徑約1 mm(圖2D);出現(xiàn)白化苗現(xiàn)象(圖2E)。

        以莖段為外植體進(jìn)行無(wú)性克隆的繁育途徑為莖段→誘導(dǎo)不定芽→不定芽增殖→誘導(dǎo)不定根→完整植株,不定芽增殖率約為4.5,繼代培養(yǎng)周期45 d,1年1個(gè)外植體可生產(chǎn)出16萬(wàn)株組培苗,苗株高且健壯、葉片大,生根后即可出苗;以種子進(jìn)行非共生萌發(fā)的繁殖途徑為種子→原球莖→根狀莖→長(zhǎng)根長(zhǎng)葉→完整植株,原球莖分化形成的苗株完整但矮小纖細(xì)、生長(zhǎng)較慢,必須經(jīng)過(guò)2~3次壯苗培養(yǎng)后方可成長(zhǎng)為大苗,總培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)270~300 d,1個(gè)蒴果可以生產(chǎn)出數(shù)萬(wàn)株種子苗。

        2.4生根培養(yǎng)比較以莖段為外植體進(jìn)行無(wú)性克隆的繁殖途徑中,增殖階段符合要求的苗株生根培養(yǎng)60~90 d后,苗株高8~10 cm,節(jié)間較長(zhǎng),莖粗壯;展開(kāi)葉片4片以上,葉片大、金線清晰;根2~4條,長(zhǎng)3 cm以上,根毛豐富(圖1E),無(wú)需經(jīng)過(guò)專門的壯苗培養(yǎng)。

        以種子進(jìn)行非共生萌發(fā)的繁殖途徑中,原球莖直接分化成形態(tài)完全的苗株,小苗生長(zhǎng)時(shí)有數(shù)量不等的細(xì)根,除極少數(shù)苗在生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生側(cè)芽,大多數(shù)苗都是單株生長(zhǎng)。2~3次壯苗培養(yǎng)后,苗高6~8 cm,莖直徑約2 mm,節(jié)間較短,根細(xì)長(zhǎng)且根毛豐富,有4片以上展開(kāi)葉片(圖2F),無(wú)需專門的生根培養(yǎng)即可出苗。

        金線蓮在組織培養(yǎng)過(guò)程中,生根較為容易[7]。無(wú)性克隆繁殖途徑中,在增殖階段即有部分大苗長(zhǎng)出根,生根培養(yǎng)時(shí),苗株莖節(jié)處由下至上依次長(zhǎng)出根,生根后苗生長(zhǎng)較快;種子非共生萌發(fā)后得到的苗下部在培養(yǎng)基表面匍匐生長(zhǎng),每個(gè)莖節(jié)上均生有根,數(shù)量較多,但苗株生長(zhǎng)相對(duì)較慢。相比之下,種子苗不需要專門的生根培養(yǎng),但是也要經(jīng)過(guò)數(shù)次壯苗培養(yǎng)才能達(dá)到出苗標(biāo)準(zhǔn),2種方式各有優(yōu)勢(shì)。

        2.5煉苗移栽大棚種植情況表明,2種繁殖途徑的生根苗存活率均為95%以上,種植30 d后可以觀察到苗株生長(zhǎng)明顯,90 d內(nèi)生長(zhǎng)情況無(wú)明顯差別,仿野生種植的生長(zhǎng)對(duì)比則有待進(jìn)一步研究。羅安雄等[3]認(rèn)為,無(wú)性繁殖雖能保持母本的優(yōu)良特性,但適應(yīng)外界環(huán)境的能力差,與該試驗(yàn)結(jié)果有差別,有待進(jìn)一步比較。

        不同種植密度的苗叢在試驗(yàn)中,單株和2株苗生長(zhǎng)90 d后差別不明顯,3株一叢相比之下莖節(jié)間較長(zhǎng),葉稍小。綜合考慮苗生長(zhǎng)質(zhì)量和空間、材料利用率,可以采取2株一叢、叢距5 cm的種植方式。

        3 結(jié)論

        2種不同繁殖途徑的對(duì)比表明金線蓮以莖段外植體進(jìn)行無(wú)性克隆繁殖具有更多優(yōu)勢(shì):誘導(dǎo)時(shí)間短、發(fā)生過(guò)程簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)速度快、芽苗健壯高大,誘導(dǎo)形成的無(wú)菌繁殖系可以根據(jù)生產(chǎn)需要進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng),繁殖出大量的能保持母本的優(yōu)良性狀的組培種苗。蒴果的消毒簡(jiǎn)單,種子萌發(fā)成原球莖后,分化成單株苗,整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程相對(duì)緩慢,苗株相對(duì)矮小,且存在變異的情況,在后續(xù)培養(yǎng)中難以保證種苗一致性。

        隨著金線蓮藥用和保健價(jià)值被逐漸發(fā)掘,其規(guī)?;?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)體系也在各地逐漸建立。在組培生產(chǎn)中,要建立快速、高效的快繁體系,同時(shí)必須保證所繁育的種苗具有親本的優(yōu)良特性,否則會(huì)給后期生產(chǎn)和種植造成巨大的損失。在選擇具有優(yōu)良性狀親本的同時(shí),需要選擇能保持親本特性,且穩(wěn)定、高效、經(jīng)濟(jì)的繁殖途徑。

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