鄭 楓，黎倩蕓，葉志聰，曾宋君，吳坤林*

(1.中國(guó)科學(xué)院華南植物園，廣東廣州 510650；2.廣州甘潤(rùn)堂生物科技有限公司，廣東廣州 510900)

金線蓮[Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl]即金線蘭，別名金線入骨消、鳥人參等，是蘭科開(kāi)唇蘭屬的一種多年生珍稀藥用草本植物，有清熱涼血、滋陰降火、消炎止痛之功效，民間多用于小兒高燒不退、驚風(fēng)，現(xiàn)也被應(yīng)用于糖尿病、癌癥等疑難病癥的治療。金線蓮對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較苛刻[1]，且種子發(fā)育不完全，自然狀態(tài)下極難萌發(fā)，通過(guò)分根法或扦插法繁殖系數(shù)極低，加上近年來(lái)生態(tài)環(huán)境日益惡化和藥農(nóng)過(guò)度采挖，金線蓮的野生蘊(yùn)藏量日益稀少。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是種苗繁育的有效手段。從20世紀(jì)90年代起，關(guān)于金線蓮的組織培養(yǎng)技術(shù)就已有報(bào)道，主要是對(duì)單一繁殖途徑的外植體選擇[2-3]、培養(yǎng)基類型[4]、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度[5]、工廠化育苗技術(shù)[6]以及移栽[7-9]等方面進(jìn)行研究，針對(duì)不同繁殖途徑的比較研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者對(duì)金線蓮組織培養(yǎng)中種子的非共生萌發(fā)和以莖段為外植體建立的無(wú)性克隆方法這2種繁殖途徑進(jìn)行比較分析，篩選出穩(wěn)定、高效的組培繁育體系，以期為專業(yè)化、規(guī)模化種苗繁育提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1材料以野生金線蓮的莖段和對(duì)其人工授粉獲得的成熟蒴果為外植體。野生金線蓮于2015年8月采自廣東省廣州市從化區(qū)天湖。

1.2方法

1.2.1外植體的消毒。

1.2.1.1以野生金線蓮的莖段為外植體。取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲害的野生金線蓮全株，用軟毛刷在流水下將苗株表面小心洗凈，去掉根、葉片和葉鞘，頂部未展開(kāi)葉片可保留約1 cm。用洗衣粉水浸泡，同時(shí)輕輕搖動(dòng)約10 min，清水洗凈后拿至超凈工作臺(tái)。將金線蓮莖條切成2 cm左右?guī)Ч?jié)莖段，先用75%乙醇浸泡30 s，在0.1% HgCl2中分別浸泡并搖動(dòng)5、8、10、13、16 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，無(wú)菌紙吸干莖段表面水分，切去兩端各1～2 mm，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每個(gè)處理接種15瓶，每瓶接種1個(gè)莖段。培養(yǎng)40 d時(shí)觀察生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)其污染率、成功率和誘導(dǎo)率。

1.2.1.2以野生金線蓮的成熟蒴果為外植體。取野生金線蓮的成熟蒴果，流水下洗凈后，浸泡在洗衣粉水中并輕輕搖動(dòng)約10 min，清水洗凈后拿至超凈工作臺(tái)。75%乙醇浸泡30 s，再在0.1% HgCl2中浸泡并搖動(dòng)15 min，無(wú)菌水沖洗3～5次后，用無(wú)菌紙吸干蒴果表面水分，切開(kāi)后將內(nèi)部種子均勻撒在播種培養(yǎng)基表面。30 d時(shí)統(tǒng)計(jì)存活情況。

1.2.2無(wú)菌繁殖系的建立。將無(wú)菌存活的莖段外植體接種到以MS為基本培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基1～4中；將無(wú)菌存活的種子接種到以1/2MS為基本培養(yǎng)基的播種培養(yǎng)基5～9中。

1.2.3增殖培養(yǎng)。將莖段外植體誘導(dǎo)出的簇生不定芽進(jìn)行分切，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基10～13中，增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA不同濃度的組合。

1.2.4生根培養(yǎng)。將增殖苗瓶中高度3 cm以上、葉片張開(kāi)2片以上、莖粗壯的金線蓮苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基14中。種子苗生長(zhǎng)到2～3 cm高時(shí)轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基15中。

1.2.5培養(yǎng)條件。培養(yǎng)溫度(23±2)℃，光照強(qiáng)度1 000～1 500 lx，光照時(shí)間12 h/d。

1.2.6培養(yǎng)基配制。不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基1～4：MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 2.0～5.0 mg/L；播種培養(yǎng)基5～9：以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA(0、0.5 mg/L)和NAA(0、0.3、0.4、0.5、1.0 mg/L)；增殖培養(yǎng)基10～13：MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 2.0～5.0 mg/L+蛋白胨3.0 g/L；生根培養(yǎng)基14：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 5.0 mg/L+蛋白胨3.0 g/L+活性炭3.0 g/L；壯苗培養(yǎng)基15：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蛋白胨3.0 g/L+活性炭2.0 g/L。每種培養(yǎng)基中均添加白糖30 g/L、卡拉膠7.2 g/L，調(diào)節(jié)pH為5.4。

1.2.7煉苗移栽。金線蓮生根苗生長(zhǎng)到高度7～8 cm、葉3片以上、根2條以上時(shí)，將其擺放在種植大棚內(nèi)煉苗7～10 d，以適應(yīng)外界環(huán)境。將生根苗從培養(yǎng)瓶中取出，用清水洗凈，并用多菌靈、百菌清等殺菌藥浸泡10 min?；|(zhì)選用泥炭土∶珍珠巖=3∶1；分別以1、2、3株苗為一叢進(jìn)行種植，苗叢間隔3 cm。將2種繁殖途徑獲得的生根苗分別進(jìn)行移栽，每種密度種植3個(gè)托盤，每個(gè)托盤種植54穴，放置到大棚相同位置進(jìn)行養(yǎng)護(hù)。

2 結(jié)果與分析

2.1外植體消毒效果比較由表1可知，隨著0.1%HgCl2消毒時(shí)間的加長(zhǎng)，莖段外植體的污染率下降，而死亡率上升。同時(shí)也觀察到金線蓮越下端的莖段，污染率越高，尤其是長(zhǎng)有根的莖段，消毒成功率極低；近頂芽的莖節(jié)污染率較低，但是隨HgCl2消毒時(shí)間延長(zhǎng)，莖節(jié)處縊縮死亡明顯增多。金線蓮莖段外植體最佳消毒方法為預(yù)處理→75%乙醇30 s→ 0.1%HgCl210 min →無(wú)菌水沖洗3～5次，消毒成功率可以達(dá)66.7%。金線蓮蒴果消毒后播種120瓶，成功105瓶，成功率為87.5%。從消毒效果來(lái)看，蒴果的消毒比莖段更方便、高效。

表1HgCl2消毒時(shí)間對(duì)金線蓮莖段外植體消毒成功率的影響

Table1EffectofHgCl2disinfectiontimeondisinfectionsuccessrateofexplantsofA.roxburghii

消毒時(shí)間Disinfection timemin污染率Contamination rate∥%死亡率Mortality rate∥%成功率Success rate∥%5100.000873.3026.71026.76.766.71326.733.340.01620.073.36.7

2.2無(wú)菌繁殖系建立比較金線蓮莖段外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，莖節(jié)處腋芽萌動(dòng)，出現(xiàn)乳白色凸起(圖1A)；培養(yǎng)40 d時(shí)，凸起處生長(zhǎng)為新芽(圖1B)；培養(yǎng)70 d時(shí)大部分莖段能誘導(dǎo)出健壯的簇狀叢生芽(圖1C)。由表2可知，培養(yǎng)基4中不定芽發(fā)生效率最高，40 d時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)90%；莖尖伸長(zhǎng)生長(zhǎng)明顯，其下端莖節(jié)處易發(fā)生膨大，并生長(zhǎng)出數(shù)個(gè)不定芽；中間莖段較易發(fā)生簇狀不定芽。

注：A.莖段外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d，莖節(jié)處發(fā)生乳白色凸起；B.莖段外植體莖節(jié)誘導(dǎo)培養(yǎng)40 d，凸起處生長(zhǎng)的新芽；C.莖段外植體誘導(dǎo)出的簇狀叢生芽；D.叢生芽穩(wěn)定增殖；E.無(wú)性克隆繁殖途徑生根苗Note：A.A white outgrowth started to develop from stem nodules after being induced from stem explants for 10 days；B.New buds growing at the outgrowths after being induced from stem explants for 40 days；C.Shoot clusters were induced from stem explants；D.Shoot clusters propagated efficiently；E.Plantlets were generated from plant cloning system圖1 金線蓮無(wú)性克隆繁殖途徑Fig.1 Asexual cloning propagation pathway of A. roxburghii

Table2Effectsofdifferentconcentrationsof6-BAoninductionofclusteredshootsfromstemsegments

金線蓮種子在1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)30～40 d時(shí)均能萌發(fā)形成淡黃色原球莖；后逐漸長(zhǎng)出絲狀白色表皮毛(圖2A)，并分化出莖尖；培養(yǎng)70 d時(shí)，可形成基部具表皮、毛頂部為莖尖的根狀莖(圖2B)；培養(yǎng)150 d時(shí)才形成根莖葉俱全的小植株(圖2C)。培養(yǎng)基中添加少量的NAA、6-BA可提高種子萌發(fā)率(表3)。

從發(fā)生方式、發(fā)生時(shí)間和生長(zhǎng)情況上比較，2種繁殖途徑建立無(wú)菌繁殖系的方式存在明顯差異。莖段外植體能更快完成誘導(dǎo)，不定芽主要發(fā)生在莖節(jié)上，最早10 d左右便能觀察到萌動(dòng)，且芽體健壯；大部分金線蓮種子培養(yǎng)30 d時(shí)在各播種培養(yǎng)基中均能萌發(fā)，但需培養(yǎng)150 d才能形成根莖葉俱全的繁殖系。總體看來(lái)，莖段外植體的誘導(dǎo)效率高，且叢生芽芽體健壯，所建立的無(wú)菌繁殖系明顯優(yōu)于種子無(wú)菌播種形成的繁殖系。

注：A.種子萌發(fā)生長(zhǎng)出表皮毛；B.播種70 d時(shí)苗況；C.播種150 d時(shí)苗況；D.播種240 d時(shí)苗況；E.種子萌發(fā)生長(zhǎng)出的白化苗；F.種子非共生萌發(fā)繁殖途徑生根苗Note：A.Formation of ectopic trichome during seed germination；B.Seedlings after sowing for 70 days；C.Seedlings after sowing for 150 days；D.Seedlings after sowing for 240 days；E.Formation of albino seedling during seed germination；F.Seedlings were generated from non-asymbiotic germination圖2 金線蓮種子非共生萌發(fā)繁殖途徑Fig.2 Non-symbiotic germination propagation pathway of A. roxburghii seeds

Table3Effectsofdifferentconcentrationsof6-BAandNAAonseedgerminationofA.roxburghii

培養(yǎng)基編號(hào)Medium No.6-BA濃度Concentration of 6-BA∥mg/LNAA濃度Concentration of NAA∥mg/L萌發(fā)率 Germination rate∥%50085.3 a600.385.2 b700.495.8 b800.594.1 b90.51.093.5 b

注：同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Note：Different small letters within the same column mean significant differences(P< 0.05)

2.3增殖及壯苗培養(yǎng)比較在培養(yǎng)基4中誘導(dǎo)出的叢生芽，繼續(xù)培養(yǎng)則發(fā)生的新芽數(shù)多且小、節(jié)間變短、葉片變小，而在培養(yǎng)基2中，新芽健壯，且能夠穩(wěn)定增殖(圖1D)，更加適宜叢生芽的增殖培養(yǎng)。

培養(yǎng)150 d時(shí)，種子苗莖部在壯苗培養(yǎng)基表面匍匐生長(zhǎng)2～4個(gè)莖節(jié)，長(zhǎng)出1～4條根，綠色葉片逐漸長(zhǎng)大、出現(xiàn)葉紋(圖2C)；培養(yǎng)240 d時(shí)，小苗的莖變得更粗壯，葉片及莖逐漸由綠色或淺黃色變成紅棕色，且金線清晰，苗平均高度4 cm，莖直徑約1 mm(圖2D)；出現(xiàn)白化苗現(xiàn)象(圖2E)。

以莖段為外植體進(jìn)行無(wú)性克隆的繁育途徑為莖段→誘導(dǎo)不定芽→不定芽增殖→誘導(dǎo)不定根→完整植株，不定芽增殖率約為4.5，繼代培養(yǎng)周期45 d，1年1個(gè)外植體可生產(chǎn)出16萬(wàn)株組培苗，苗株高且健壯、葉片大，生根后即可出苗；以種子進(jìn)行非共生萌發(fā)的繁殖途徑為種子→原球莖→根狀莖→長(zhǎng)根長(zhǎng)葉→完整植株，原球莖分化形成的苗株完整但矮小纖細(xì)、生長(zhǎng)較慢，必須經(jīng)過(guò)2～3次壯苗培養(yǎng)后方可成長(zhǎng)為大苗，總培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)270～300 d，1個(gè)蒴果可以生產(chǎn)出數(shù)萬(wàn)株種子苗。

2.4生根培養(yǎng)比較以莖段為外植體進(jìn)行無(wú)性克隆的繁殖途徑中，增殖階段符合要求的苗株生根培養(yǎng)60～90 d后，苗株高8～10 cm，節(jié)間較長(zhǎng)，莖粗壯；展開(kāi)葉片4片以上，葉片大、金線清晰；根2～4條，長(zhǎng)3 cm以上，根毛豐富(圖1E)，無(wú)需經(jīng)過(guò)專門的壯苗培養(yǎng)。

以種子進(jìn)行非共生萌發(fā)的繁殖途徑中，原球莖直接分化成形態(tài)完全的苗株，小苗生長(zhǎng)時(shí)有數(shù)量不等的細(xì)根，除極少數(shù)苗在生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生側(cè)芽，大多數(shù)苗都是單株生長(zhǎng)。2～3次壯苗培養(yǎng)后，苗高6～8 cm，莖直徑約2 mm，節(jié)間較短，根細(xì)長(zhǎng)且根毛豐富，有4片以上展開(kāi)葉片(圖2F)，無(wú)需專門的生根培養(yǎng)即可出苗。

金線蓮在組織培養(yǎng)過(guò)程中，生根較為容易[7]。無(wú)性克隆繁殖途徑中，在增殖階段即有部分大苗長(zhǎng)出根，生根培養(yǎng)時(shí)，苗株莖節(jié)處由下至上依次長(zhǎng)出根，生根后苗生長(zhǎng)較快；種子非共生萌發(fā)后得到的苗下部在培養(yǎng)基表面匍匐生長(zhǎng)，每個(gè)莖節(jié)上均生有根，數(shù)量較多，但苗株生長(zhǎng)相對(duì)較慢。相比之下，種子苗不需要專門的生根培養(yǎng)，但是也要經(jīng)過(guò)數(shù)次壯苗培養(yǎng)才能達(dá)到出苗標(biāo)準(zhǔn)，2種方式各有優(yōu)勢(shì)。

2.5煉苗移栽大棚種植情況表明，2種繁殖途徑的生根苗存活率均為95%以上，種植30 d后可以觀察到苗株生長(zhǎng)明顯，90 d內(nèi)生長(zhǎng)情況無(wú)明顯差別，仿野生種植的生長(zhǎng)對(duì)比則有待進(jìn)一步研究。羅安雄等[3]認(rèn)為，無(wú)性繁殖雖能保持母本的優(yōu)良特性，但適應(yīng)外界環(huán)境的能力差，與該試驗(yàn)結(jié)果有差別，有待進(jìn)一步比較。

不同種植密度的苗叢在試驗(yàn)中，單株和2株苗生長(zhǎng)90 d后差別不明顯，3株一叢相比之下莖節(jié)間較長(zhǎng)，葉稍小。綜合考慮苗生長(zhǎng)質(zhì)量和空間、材料利用率，可以采取2株一叢、叢距5 cm的種植方式。

3 結(jié)論

2種不同繁殖途徑的對(duì)比表明金線蓮以莖段外植體進(jìn)行無(wú)性克隆繁殖具有更多優(yōu)勢(shì)：誘導(dǎo)時(shí)間短、發(fā)生過(guò)程簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)速度快、芽苗健壯高大，誘導(dǎo)形成的無(wú)菌繁殖系可以根據(jù)生產(chǎn)需要進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)，繁殖出大量的能保持母本的優(yōu)良性狀的組培種苗。蒴果的消毒簡(jiǎn)單，種子萌發(fā)成原球莖后，分化成單株苗，整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程相對(duì)緩慢，苗株相對(duì)矮小，且存在變異的情況，在后續(xù)培養(yǎng)中難以保證種苗一致性。

隨著金線蓮藥用和保健價(jià)值被逐漸發(fā)掘，其規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)體系也在各地逐漸建立。在組培生產(chǎn)中，要建立快速、高效的快繁體系，同時(shí)必須保證所繁育的種苗具有親本的優(yōu)良特性，否則會(huì)給后期生產(chǎn)和種植造成巨大的損失。在選擇具有優(yōu)良性狀親本的同時(shí)，需要選擇能保持親本特性，且穩(wěn)定、高效、經(jīng)濟(jì)的繁殖途徑。