王曉梅，遲德富，宇佳

(東北林業(yè)大學林學院, 黑龍江 哈爾濱 150040)

蛻皮激素(ecdysone)是一類調(diào)節(jié)昆蟲蛻皮、變態(tài)，影響昆蟲發(fā)育的內(nèi)源激素，最早由生物學家Polish于1919年提出[1]。1954年，科學家們首次從50多萬頭家蠶(Bombyxmori)蛹中成功分離出α-蛻皮激素[2]，并確定了α、β-蛻皮激素的甾體結構[1]。研究發(fā)現(xiàn)，這些甾體化合物多在昆蟲幼期的前胸腺產(chǎn)生，在成蟲期轉由性腺分泌。蛻皮激素是以膽固醇作為骨架來合成的。但昆蟲本身并不能合成膽固醇，而是直接或間接地從植物中得到。所以，昆蟲在幼蟲期間需要不斷進行取食植物來獲取蛻皮激素的前體物質(zhì)[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，在自然界中有300多種植物中都含有類似于昆蟲蛻皮激素的次生代謝物。這些次生代謝物被統(tǒng)稱為植物蛻皮甾醇(phytoecdysteroid)。含植物蛻皮甾醇的植物中，鴨跖草科、馬鞭草科、唇形科、菊科、莧科、天南星科和羅漢松科的植物居多[4-7]。而植物中植物蛻皮甾醇含量往往遠高于昆蟲體內(nèi)蛻皮激素的含量[4]。為此，很多學者致力于植物蛻皮甾醇的種類鑒定、提取工藝、功能等方面的研究[8-9]。

匍枝筋骨草(Ajugalobata)為唇形科(Lamiaceae)筋骨草屬(Ajuga)植物，主要生長在路邊、溪邊、山地丘陵等陰涼濕潤之地，具有抗菌消炎、清熱解毒、化痰止咳等作用。匍枝筋骨草全株均含有植物蛻皮甾醇(phytoecdysteroid)中的一種主要成分，即β-蛻皮甾酮(β-ecdysterone，β-EC)，也被稱為20-羥基蛻皮激素(20-hydroxyecdysone)或β-蛻皮激素(β-ecdysone)[10-11]，且含量較高，約為全株重量的0.1%。陳小霞等[12]對3種筋骨草屬植物進行分析發(fā)現(xiàn)金瘡小草(Ajugadecumbens)中所含β-EC高達4.4976 mg·g-1；而邱志國等[11]對筋骨草蛻皮激素類物質(zhì)的分析發(fā)現(xiàn)線葉筋骨草中β-EC含量可達414 μg·g-1；黎昕等[13]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加1 mg·L-16-BA可促使筋骨草細胞內(nèi)β-EC含量，達0.2092 g·L-1；錢晶晶等[14]發(fā)現(xiàn)匍枝筋骨草懸浮細胞中β-EC含量可達0.246 g·L-1。

茉莉酸甲酯(jasmonic acid methyl ester，MeJA)是從素馨花(Jasminumgrandiflorum)精油中分離出來的一種揮發(fā)性物質(zhì)[15]，對植物有著廣泛的生理作用[16]。它可以抑制植物生長，增加植物的抗性，提高脅迫能力。同時，它作為誘導子，可以參與膜間內(nèi)源信號的轉導，還可間接誘導產(chǎn)生大量次生代謝物質(zhì)[17-18]，具有類似于ABA的作用[17]。

本實驗建立了匍枝筋骨草生長模型及β-EC積累模型，通過在匍枝筋骨草懸浮細胞中添加MeJA，研究對其生長狀況、β-EC積累的相關影響。旨在促進提高β-EC產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)β-EC奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗在2016年5月在室內(nèi)進行，于2017年3月完成試驗。根據(jù)趙曉杰等[19]建立的匍枝筋骨草體系，選取繼代4～10代的懸浮細胞為實驗材料。細胞室培養(yǎng)條件：溫度(23±2) ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗，濕度50%～60%，光照強度2000 lx，搖床轉速120～130 r·min-1。

1.2 實驗方法

1.2.1生物量的測定 在無菌條件下，取4～10代懸浮細胞5 g，加入至50 mL的懸浮培養(yǎng)液中(接種量10%)，在搖床上分別培養(yǎng)4, 7, 10 d后添加不同濃度的誘導子茉莉酸甲酯，每天取樣觀察細胞生長狀況，每處理重復3次，處理的細胞液過300目細胞篩(孔徑為48 μm)，擠壓吸干水分，稱其重量即得鮮重。鮮細胞在60 ℃的條件下烘干至恒重，即得干重。

1.2.2誘導子MeJA配置 取1 mL的MeJA標準品(95%，sigma公司)溶于50%的無水乙醇中，定容至50 mL，即得MeJA母液。經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾后，向50 mL的培養(yǎng)液中分別添加6、29、57、86、115 μL的茉莉酸甲酯母液，使培養(yǎng)液中誘導子茉莉酸甲酯的最終質(zhì)量濃度分別為10、50、100、150和200 μmol·L-1。在對照組的培養(yǎng)瓶中亦加入對應體積的50%乙醇。

1.2.3樣品的制備 所得干細胞在研缽中加入液氮，在低溫條件下研磨成粉，取0.1 g干品粉末溶于2 mL甲醇中，在暗條件下浸提24 h，超聲振蕩1 h，微波消解10 min(消解溫度：50 ℃，功率：300 W×2，壓強：當前壓力的兩倍)，靜置取上清液，用0.45 μm的有機濾膜過濾，即得測定液。

1.3 測定方法

用HPLC Waters 2695檢測β-EC含量。檢測條件：進樣量10 μL，流速0.6 mL·min-1，Waters 2996 PDA檢測器(波長范圍：190～800 nm)，流動相(甲醇∶水=1∶1)，檢測波長254 nm，柱溫：25 ℃。色譜柱型號：C18(4.6×250 mm，5 μm 粒度)。

1.4 提取方法的驗證與儀器校準

1.4.1蛻皮激素標準曲線的制作 取蛻皮激素標準樣品8 mg溶于10 mL色譜純甲醇中，即得0.8 g·L-1β-EC的標準液。再依次分別配置濃度梯度為0.4、0.2、0.1、0.05 g·L-1的蛻皮激素標準液，分別進樣10 μL，重復進樣3次，制作β-EC線性回歸方程：y=3×107x-451985，R2=0.9993。

1.4.2精密度試驗 取3個不同濃度梯度的標準液，分別進樣10 μL，重復進樣5次，記錄峰面積，測得3個處理峰面積分別是5720135、11483655、23242561，計算測得相對標準偏差(RSD)=0.94%。

1.4.3重復性試驗 取3個處理的匍枝筋骨草粉末，每個處理稱取5份，分別提取，進樣，記錄峰面積，測得3個峰面積分別是26885、1921143、2159040，計算測得RSD=1.05%。

1.4.4穩(wěn)定性試驗 取3個處理已制備的待測液，分別在0、4、8、12、24 h進樣測定，記錄峰面積，測得3個峰面積分別是2149598、2100529、3284488，計算測得RSD=0.96%。

1.4.5加樣回收率試驗 取3個處理的待測液，分別添加標準液，每個處理按照其所含β-EC濃度的80%、100%、120%設置3個濃度梯度，重復進樣6次，記錄峰面積，測得3個峰面積分別是1333620、2527232、2167941，測得平均加樣回收率(P)=97.26%，平均RSD=1.38%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003進行圖表的制作，采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)單因素方差分析，多重比較采用鄧肯極差檢驗法(SSR法)，顯著性水平F=0.05。相關性分析采用Pearson法進行簡單相關分析。生長模型采用Logistic，利用Origin 8進行曲線的擬合度和相關參數(shù)的計算。

2 結果與分析

2.1 匍枝筋骨草的生長曲線及蛻皮甾酮積累曲線的規(guī)律

2.1.1細胞生長曲線 取懸浮細胞5 g加入50 mL的培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)周期20 d。根據(jù)圖1細胞生長曲線得知，細胞鮮重曲線呈現(xiàn)Logistic型增長趨勢，分為4個生長期。0～4 d為細胞生長的遲滯期。此期細胞生長緩慢，增殖倍數(shù)在37%～85%之間。4～10 d為細胞生長的快速增殖期。此期細胞呈對數(shù)生長，細胞生長快速。其中第4天為細胞對數(shù)生長的初始期，第10天達到細胞生長的高峰期，鮮重達到32.12 g，增殖倍數(shù)達到351%。10～18 d為細胞生長的平緩期，此期細胞保持在一個穩(wěn)定的水平上，鮮重在31.29～32.72 g。18～20 d進入細胞生長的衰落期，此期細胞生長量逐漸減低，細胞開始褐化，逐漸老化死亡。細胞干重曲線與細胞鮮重曲線趨勢相似，4 d細胞干重為0.22 g，8 d進入干物質(zhì)積累高峰期，細胞干重達到0.58 g，于18 d開始死亡。

2.1.2細胞內(nèi)β-蛻皮甾酮動態(tài)積累曲線 從圖2看出，β-蛻皮甾酮(β-EC)積累曲線屬于與生長偶聯(lián)型的次生代謝模型，且呈線性正相關。在生長期第4天進入β-EC快速積累期，第10天達到合成的高峰期，細胞中β-EC含量達到0.25 mg·g-1，10～16 d期間β-EC含量略有降低，但降低的速度緩慢，16 d后積累量迅速下降。

2.1.3細胞生長和β-蛻皮甾酮積累曲線的模型擬合 以細胞培養(yǎng)天數(shù)(d)為自變量(x)，分別以細胞鮮重(g)、細胞干重(g)、β-EC合成量(mg·g-1)為因變量(y)，建立生長模型。從表1得知，鮮重、干重、β-EC含量生長模型都為Logistic，說明三者的變化規(guī)律相對同步，擬合曲線基本一致。其中，細胞鮮重、干重生長曲線決定系數(shù)達到0.95，擬合程度較好。而β-EC積累曲線擬合模型的決定系數(shù)為0.86。

圖1 匍枝筋骨草懸浮細胞生長曲線Fig.1 Growth curves of A. lobata suspension cells

圖2 匍枝筋骨草懸浮細胞β-蛻皮甾酮含量動態(tài)曲線Fig.2 Content dynamic curve of β-EC content in A. lobata suspension cells

類別Category曲線類型Curve types擬合方程Fitting equation決定系數(shù)R2鮮重Cell fresh weight邏輯斯蒂曲線LogisticY=30.88-24.14/[1+(x/6.12)8.85]0.95干重Cell dry weight邏輯斯蒂曲線LogisticY=0.55-0.40/[1+(x/5.43)6.91]0.95β-EC含量β-EC content邏輯斯蒂曲線LogisticY=0.22-0.16/[1+(x/5.28)7.52]0.86

2.2 添加誘導子MeJA對筋骨草懸浮細胞的影響

2.2.1細胞鮮重的變化 根據(jù)表2得知，在培養(yǎng)了4 d的懸浮細胞培養(yǎng)體系中，添加了10、50、100、150、200 μmol·L-1MeJA。 在處理后的第1天， 除添加100 μmol·L-1濃度的MeJA外， 其他處理懸浮細胞鮮重與CK差異顯著(P<0.01)。在處理后的第3、5、7、10天，各處理則均與CK差異顯著(P<0.05)。而在經(jīng)MeJA處理后的5個觀測時間點內(nèi)，各濃度處理組間均差異顯著(P<0.05)。其中，添加10、50 μmol·L-1濃度下，處理組懸浮細胞鮮重均高于CK，100、150、200 μmol·L-1濃度下細胞鮮重與CK相比表現(xiàn)抑制作用。在各個添加濃度中，50 μmol·L-1濃度下細胞鮮重增加值相對較高，在處理后的5個觀測時間點內(nèi)，細胞鮮重分別達到了11.68、25.21、33.76、35.10和32.20 g，細胞鮮重分別比同期CK增加了18.42%、33.15%、16.25%、12.16%和10.59%。而200 μmol·L-1濃度下細胞鮮重降低最顯著，在處理后的5個觀測時間點內(nèi)，細胞鮮重分別比同期CK下降了38.88%、32.86%、31.58%、26.35%和27.63%。

表2 在懸浮細胞生長的不同時間添加不同濃度的茉莉酸甲酯對筋骨草生物量的影響Table 2 The influence on A. lobata suspension cell biomass after adding different concentration of MeJA at different culture time

注：表中數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤。同列中*表示在同一時間內(nèi)CK和處理差異顯著(P<0.05)。同列中不同小寫字母表示同一時間內(nèi)處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Notes: The data are given as means±SE in the Table.*denote significant different atP<0.05 compare with control at the same time in the same column. Different lowercase letters indicate significant different atP<0.05 at the same time in the same column. The same below.

在培養(yǎng)了7 d的懸浮細胞培養(yǎng)體系中添加MeJA后細胞鮮重變化規(guī)律與培養(yǎng)了4 d的相似。在處理后1、3、5、7、10 d，各濃度處理組細胞鮮重均與CK差異顯著(P<0.01)，且各濃度處理組間差異均顯著(P<0.01)。其中，10、50 μmol·L-1濃度下細胞鮮重均高于CK，表現(xiàn)促進作用。100、150、200 μmol·L-1濃度下細胞鮮重明顯低于CK，表現(xiàn)抑制作用。在各個濃度處理組中，50 μmol·L-1濃度下細胞鮮重增加最為顯著，表現(xiàn)最佳，在處理后的5個時間點內(nèi)鮮重分別達到27.20、35.90、33.89、31.34、29.26 g，與同期CK相比分別增重9.21%、18.17%、9.34%、7.61%、8.17%。而200 μmol·L-1濃度下細胞鮮重則降低較顯著，與同期CK相比分別下降35.56%、27.10%、21.57%、17.16%、14.85%。

在培養(yǎng)了10 d的懸浮細胞培養(yǎng)體系中添加不同濃度的MeJA，處理后第1、3、5、7、10天，各濃度處理組細胞鮮重均與CK差異顯著(P<0.05)。處理后第1、3天，各濃度處理組間差異均顯著(P<0.05)。而處理后第5天，除100與150 μmol·L-1外，其他濃度處理組間差異均顯著(P<0.05)。處理后第7天，除10與50 μmol·L-1、150與200 μmol·L-1外，其他濃度處理組間差異均顯著(P<0.05)。處理后第10天，各處理組間差異均不顯著(P>0.05)。其中，處理后第1天，除添加10 μmol·L-1濃度的MeJA外，其他濃度處理懸浮細胞鮮重均顯著低于CK。在處理后的第3、5、7、10天，各濃度處理組均明顯低于CK。在添加的各個濃度處理組中，只有處理后第1天的10 μmol·L-1濃度下細胞鮮重有所增加，與同期CK相比僅增重2.85%。在處理后的第1、3、5、7天，200 μmol·L-1濃度下細胞鮮重均顯著降低，細胞鮮重分別比同期CK下降了23.65%、31.01%、29.93%、24.67%。

結果表明細胞的誘導子因MeJA添加周期、濃度的不同而發(fā)生變化，同時還與處理時間的長短有密切關系。隨著處理時間的延長，細胞逐漸衰老死亡。同時，誘導子MeJA濃度的增大會加速細胞的衰老。此外，在細胞快速生長的高峰期添加MeJA可促進細胞快速衰老，而在細胞快速生長期的初始期、中期添加MeJA后，細胞的衰老速度則相對較緩。

2.2.2不同添加時間對細胞干重的影響 從圖3可看出，在培養(yǎng)了4 d的懸浮體系中添加的MeJA后，各處理組細胞干重不同。添加10 μmol·L-1后細胞干重曲線與CK曲線有一定程度的交叉重合，最大差值僅為0.026 g，差異不顯著(P>0.05)。添加50 μmol·L-1的MeJA后，細胞干重曲線在前期(添加后2～5 d)顯著高于CK曲線，最大差值達到0.203 g(P<0.05)。添加100 μmol·L-1的MeJA后，其細胞干重曲線與CK曲線相比差異不顯著(P>0.05)，表現(xiàn)輕微下降的趨勢。添加200 μmol·L-1后細胞干重曲線則表現(xiàn)完全抑制作用(P<0.05)。同時還發(fā)現(xiàn)，各個細胞干重曲線均有一個小高峰。其中50 μmol·L-1細胞干重曲線在處理后5 d達到生長高峰，干物質(zhì)積累達到0.60 g，顯著優(yōu)于其他各處理(P<0.05)。

從圖4看出，在培養(yǎng)了7 d的細胞懸浮培養(yǎng)體系中添加MeJA后，其細胞干重曲線與在培養(yǎng)了4 d的體系中添加MeJA后獲得的細胞干重曲線有相似之處。其中添加50 μmol·L-1細胞干重曲線在前期(添加后1～9 d)顯著高于CK曲線(P<0.05)，其高峰期出現(xiàn)在處理后的第3天，細胞干重達到0.62 g。而添加了200 μmol·L-1MeJA后的細胞干重曲線顯著低于CK曲線(P>0.05)。

從圖5可看出，與CK細胞干重曲線相比，在培養(yǎng)了10 d的懸浮培養(yǎng)體系中，加入各濃度的MeJA后，各處理組細胞干重曲線整體呈現(xiàn)下降趨勢，其與CK曲線最大差值達到0.216 g，顯著低于CK曲線(P>0.05)。

綜合分析圖3、4、5的試驗結果發(fā)現(xiàn)，細胞生長的不同周期添加MeJA后其細胞干重曲線有所不同。在細胞快速生長的初始期及中期添加MeJA，低濃度可促進細胞的生長。而高峰期后添加MeJA會加速細胞的老化，對細胞的生長起抑制作用。

圖3 在第4天向懸浮培養(yǎng)體系中添加 MeJA對細胞干重的影響Fig.3 The effect on cell dry weight after adding MeJA into suspension culture system at the 4th days

圖4 在第7天向懸浮培養(yǎng)體系中添加 MeJA對細胞干重的影響Fig.4 The effect on cell dry weight after adding MeJA into suspension culture system at the 7th days

圖5 在第10天向懸浮培養(yǎng)體系中添加 MeJA對細胞干重的影響Fig.5 The effect on cell dry weight after adding MeJA into suspension culture system at the 10th days

2.2.3β-蛻皮甾酮積累量的變化 根據(jù)表3得知，在培養(yǎng)了4 d的懸浮細胞培養(yǎng)體系中添加了10、50、100、150、200 μmol·L-1的MeJA。處理后第1、3、5、7、10天，各濃度處理組β-蛻皮甾酮(β-EC)積累量均與CK差異顯著(P<0.05)。在觀測的5個時間點內(nèi)，處理后第1、5、10天，各濃度處理組間β-EC積累量差異顯著(P<0.05)。而在處理后第3天，50與200 μmol·L-1濃度處理組間積累量差異不顯著(P>0.05)，其他濃度處理組間則差異顯著(P<0.05)。在處理后第7天，10、50、100、150 μmol·L-1濃度組間β-EC積累量差異顯著(P<0.05)，10與200 μmol·L-1濃度組間β-EC積累量則差異不顯著(P>0.05)。結果發(fā)現(xiàn)，隨著MeJA濃度的增大，β-EC積累量呈先升后降趨勢。在各濃度處理組中，100 μmol·L-1濃度下β-EC積累量表現(xiàn)最佳，在處理后的5個時間觀測點內(nèi)積累量分別達到1.5465、2.7766、0.7544、0.4735、0.2808 mg·g-1，分別為同期CK的15.84、20.77、2.48、0.80、0.13倍。而在處理后第1、3、5天，10 μmol·L-1濃度下β-EC積累量顯著降低，分別為同期CK的0.80、0.58、0.23倍。在處理后第7、10天，200 μmol·L-1濃度下β-EC積累量最低，分別為同期CK的0.17和0.01倍。

在培養(yǎng)了7 d的懸浮細胞培養(yǎng)體系中添加了不同濃度的MeJA處理后的5個時間觀測點內(nèi)，各濃度處理組β-EC積累量均與CK相比差異顯著(P<0.05)。在處理后第3天，除200與10 μmol·L-1濃度組間積累量則差異不顯著(P>0.05)外，其他濃度處理組間差異顯著(P<0.05)。而在處理后第1、5、7、10天，各濃度處理組間均差異顯著(P<0.05)。隨著處理濃度組依次增大，β-EC積累量表現(xiàn)先升后降。在處理后第1天，150 μmol·L-1濃度下β-EC積累量最佳，為1.4986 mg·g-1，增長率為同期CK的10.40倍。而在之后第3、5、7、10天，100 μmol·L-1濃度下β-EC積累量顯著提高，分別達到0.5541、1.2164、3.5315、0.6901 mg·g-1，增長率分別為同期CK的1.38、3.52、14.44、3.15倍。在各個添加濃度中，在處理后的第1、3天，10 μmol·L-1濃度下β-EC積累量較低，為0.3455、0.3662 mg·g-1，增長率分別為同期CK的1.62、0.98倍。而在處理的第5、7、10天，200 μmol·L-1濃度下β-EC積累量相對較低，分別為0.2626、0.2165、0.1560 mg·g-1，增長率分別比同期CK下降了2.2749%、5.3261%、6.1449%。

表3 在懸浮細胞生長的不同時間添加不同濃度的茉莉酸甲酯對筋骨草β-蛻皮甾酮含量的影響Table 3 The influence on A. lobata β-EC content after adding different concentration of MeJA at different culture time

在培養(yǎng)了10 d的懸浮細胞培養(yǎng)體系中添加了不同濃度的MeJA，處理后第1天，各濃度處理組β-EC積累量均與CK差異顯著(P<0.05)，各處理組間β-EC積累量均差異顯著(P<0.05)。此期50 μmol·L-1濃度下β-EC積累量最佳，為0.6797 mg·g-1，β-EC增長率為同期CK的1.75倍。200 μmol·L-1濃度下β-EC積累量較低，為0.2324 mg·g-1，比同期CK下降了5.8663%。處理后第3天，除了150 μmol·L-1濃度處理組外，其他濃度處理組間β-EC積累量與CK相比均差異顯著(P<0.05)。而各濃度處理組間β-EC積累量均差異顯著(P<0.05)。其中，10 μmol·L-1濃度下積累量達到1.4136 mg·g-1，增長率為同期CK的5.06倍。200 μmol·L-1濃度下積累量為0.1576 mg·g-1，比同期CK下降了32.3294%。處理后第5天，除了100 μmol·L-1濃度處理組外，10、50 μmol·L-1濃度下β-EC積累量與CK差異顯著(P<0.05)。150、200 μmol·L-1濃度下則未檢測到β-EC。10、50、100 μmol·L-1濃度組間β-EC積累量均差異顯著。其中，10 μmol·L-1濃度下積累量為0.8534 mg·g-1，增長率為同期CK的3.38倍。100 μmol·L-1濃度下積累量為0.1884 mg·g-1，比同期CK下降了3.2129%。處理后第7、10天，除CK外，各濃度處理組均未檢測到β-EC。

綜合分析發(fā)現(xiàn)，β-EC的積累量與誘導子MeJA的添加時間、處理時長以及處理濃度有直接關系。在細胞快速生長的初始期(第4天)添加MeJA后對細胞相對刺激較小，各處理與CK相比，β-EC積累量均有不同程度的提升，表現(xiàn)逐漸上升的趨勢。而在細胞的快速生長的中期添加(第7天)MeJA后，細胞中β-EC積累量則有大幅提高，在一定濃度下隨著處理天數(shù)的增加，β-EC積累量緩慢升高，而添加高濃度MeJA后，β-EC積累量表現(xiàn)為短時間內(nèi)急速升高后下降。在細胞的快速生長的高峰期(第10天)添加MeJA后對細胞刺激較大，添加低濃度的MeJA可在短時間內(nèi)刺激產(chǎn)生大量的β-EC，但是之后細胞漸漸衰老死亡，添加高濃度MeJA后，β-EC積累量則較少。

2.2.4β-蛻皮甾酮積累量與細胞干重相關性分析 以β-EC積累量為因變量，細胞干重為自變量，采用Pearson法分析MeJA的不同添加時期對β-EC積累量、細胞干重的相互影響。由表4可知，在培養(yǎng)了4 d的懸浮細胞中添加了不同濃度的MeJA后，各濃度處理組生長量與β-蛻皮甾酮(β-EC)含量都近似表現(xiàn)極顯著相關。其中，添加10、50 μmol·L-1的MeJA后，細胞生長量與β-EC含量呈現(xiàn)極顯著正相關(P<0.01)，相關系數(shù)分別達到0.918、0.929。添加150、200 μmol·L-1的MeJA兩者間亦表現(xiàn)正相關(P<0.01)，而添加100 μmol·L-1的MeJA則呈現(xiàn)負相關(P<0.01)。此期細胞生長量與β-EC含量相關性從大到小依次為：50 μmol·L-1>10 μmol·L-1>200 μmol·L-1>150 μmol·L-1>100 μmol·L-1。

在培養(yǎng)了7 d的懸浮細胞中添加了不同濃度的MeJA后細胞生長量與β-EC含量相關性和培養(yǎng)了4 d的懸浮細胞的相關性基本一致，其中添加50 μmol·L-1的MeJA后細胞生長量與β-EC含量的相關性最高，相關系數(shù)可達到0.920。不同的是，添加100、150 μmol·L-1的MeJA后細胞生長量與β-EC含量顯著性不相關(P>0.05)。此期細胞生長量與β-EC含量相關性從大到小依次為：50 μmol·L-1>10 μmol·L-1>200 μmol·L-1>150 μmol·L-1>100 μmol·L-1。

表4 不同濃度MeJA處理下β-蛻皮甾酮含量與 細胞生長量的相關分析Table 4 Correlation coefficients between β-EC content and cell growth under different concentration of MeJA

注：*和**分別表示細胞生長量與β-蛻皮甾酮含量在P<0.05和P<0.01的水平上差異顯著。

Notes:* and ** indicate significant correlation on theP<0.05 andP<0.01 level between β-EC content and cell growth.

在培養(yǎng)了10 d的懸浮細胞中添加了不同濃度的MeJA后，添加10 μmol·L-1的MeJA表現(xiàn)無顯著相關(P>0.05)，添加50、100、150、200 μmol·L-1的MeJA則都呈現(xiàn)極顯著正相關(P<0.01)，相關系數(shù)分別為0.785、0.968、0.934、0.904。此期細胞生長量與β-EC含量相關性從大到小依次為：100 μmol·L-1>150 μmol·L-1>200 μmol·L-1>50 μmol·L-1>10 μmol·L-1。

經(jīng)結果分析表明細胞生長量與β-EC含量的相關性隨著MeJA添加時間和濃度的不同而發(fā)生變化。在細胞快速生長期的初始期(第4天)添加低濃度MeJA后細胞生長量與β-EC含量的相關系數(shù)較大，而添加高濃度MeJA后相關系數(shù)則逐漸減小或為負。在細胞快速生長的中期(第7天)添加MeJA后細胞生長量與β-EC含量相關性規(guī)律與細胞快速生長期的初始期(第4天)添加相似。低濃度相關系數(shù)較大，高濃度相關系數(shù)則減小或為負。在細胞快速生長的高峰期(第10天)添加MeJA相關性規(guī)律與第4天或第7天的規(guī)律不一致。此時，添加高濃度MeJA后細胞生長量與β-EC含量的相關系數(shù)較大，添加低濃度MeJA則相關系數(shù)較小。

2.2.5β-蛻皮甾酮總含量的變化 由表5可知，向培養(yǎng)了4 d的懸浮細胞培養(yǎng)體系中添加了10、50、100、150、200 μmol·L-1的MeJA，除了處理后第3天的10、200 μmol·L-1外，其他處理組培養(yǎng)體系中所有細胞的β-EC總含量均與CK差異顯著(P<0.05)。處理后第1、5、7、10天，各處理組β-EC總含量均與CK差異顯著(P<0.05)。處理后第1天，除200與10、50 μmol·L-1濃度組間差異不顯著外(P>0.05)，各樣品處理組間β-EC總含量均差異顯著(P<0.05)。在各個濃度處理組中，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量為0.3145 mg，表現(xiàn)最佳，而10 μmol·L-1濃度下總含量較低，僅為0.0359 mg。處理后第3天， 除100與150 μmol·L-1濃度處理組間β-EC總含量差異顯著外(P<0.05)，其他處理組間β-EC總含量差異不顯著(P>0.05)。在各個濃度處理組中，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量達到0.7868 mg，200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較低，僅為0.0615 mg。處理后第5天，除200、10 μmol·L-1外，其他處理組間β-EC總含量均差異顯著(P<0.05)。在各個濃度處理組中，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，但與處理后第3天相比有所下降，為0.2816 mg。而10 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較低，僅為0.1095 mg。處理后第7天，除10、150 μmol·L-1外，其他處理組間β-EC總含量差異顯著(P<0.05)。隨著處理時間的延長，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，但與處理后第5天相比呈降低趨勢，為0.2336 mg，200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量僅為0.0813 mg。處理后第10天，除10、100 μmol·L-1外，其他處理組間β-EC總含量差異顯著(P<0.05)。在5個濃度處理組中，50 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，為0.1077 mg。200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較低，僅為0.0535 mg。

表5 在懸浮細胞生長的不同時間添加不同濃度的茉莉酸甲酯對筋骨草樣品內(nèi)β-蛻皮甾酮總含量的影響Table 5 The influence insampleson A. lobata β-EC totalcontent after adding different concentration of MeJA at different culture time

在培養(yǎng)了7 d的懸浮細胞培養(yǎng)體系中添加了不同濃度的MeJA后第3天，200 μmol·L-1濃度的β-EC總含量與CK差異不顯著(P>0.05)。處理后第7天，10、150、200 μmol·L-1濃度的β-EC總含量與CK差異亦不顯著(P>0.05)。處理后第1、5、10天，各濃度組內(nèi)β-EC總含量與CK相比均差異顯著(P<0.05)。處理后第1天，除50、150、200 μmol·L-1濃度組間β-EC總含量差異顯著外(P<0.05)，其他濃度組間β-EC總含量差異不顯著(P>0.05)。在各個濃度處理組中，150 μmol·L-1濃度下β-EC總含量最高，達到0.5244 mg，10 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較低，僅為0.1474 mg。處理后第3天，除50與100 μmol·L-1組間β-EC總含量差異不顯著外(P>0.05)，其他處理組間β-EC總含量均差異顯著(P<0.05)。在各個濃度處理組中，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，為0.2955 mg。而200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量僅為0.1339 mg。處理后第5天，各濃度處理組間β-EC總含量均差異顯著(P<0.05)。在各個濃度處理組中，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，為0.5798 mg。200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量僅為0.0797 mg。處理后第7天，除10與50、150 μmol·L-1，150和200 μmol·L-1處理樣品組間β-EC總含量差異不顯著(P>0.05)，其他濃度間β-EC總含量差異均顯著(P<0.05)。在各個濃度處理中，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量最高，與處理后第5天相比有大幅提升，達1.2124 mg，200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量僅為0.0447 mg。處理后第10天，除10與50 μmol·L-1、150與200 μmol·L-1外，其他濃度處理組間β-EC總含量均差異顯著(P<0.05)。在各個濃度處理組中，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，與處理后第7天相比有所下降，為0.1334 mg。而200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量僅為0.0302 mg。

在培養(yǎng)了10 d的懸浮細胞培養(yǎng)體系中添加了不同濃度的MeJA，處理后第1天，除150 μmol·L-1濃度的β-EC總含量與CK差異不顯著外(P>0.05)，其他濃度組β-EC總含量均與CK差異顯著(P<0.05)。各濃度處理組間β-EC總含量均差異顯著(P<0.05)。在各個濃度處理組中，50 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，為0.3013 mg，而200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量僅為0.0798 mg。處理后第3天，各濃度處理組間β-EC總含量均差異顯著(P<0.05)。此期10 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，為0.5889 mg，之后隨著添加濃度的增大，含量逐漸減少，200 μmol·L-1濃度下β-EC總含量僅為0.0384 mg。處理后第5天，10、50、100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量差異顯著(P<0.05)，150、200 μmol·L-1濃度下未檢測到β-EC。此期10 μmol·L-1濃度下β-EC總含量較高，為0.2786 mg，隨著添加濃度的增大，含量逐漸減少，100 μmol·L-1濃度下β-EC總含量僅為0.0465 mg。

結果表明，筋骨草懸浮細胞內(nèi)β-EC的含量與處理時間的長短和誘導子的濃度有直接關系，同時也與細胞自身生長狀況有關。在細胞快速生長的初始期(處理后第4天)添加MeJA，對細胞影響較小，細胞內(nèi)β-EC含量提高幅度較小，隨著處理后時間的延長，細胞逐漸衰老，細胞內(nèi)β-EC含量亦都大幅減少。細胞快速生長的中期(處理后第7天)是MeJA最適添加時期，此期對細胞刺激適中，一定濃度下可促進β-EC的產(chǎn)生和積累，獲得最高產(chǎn)量。在細胞快速生長的高峰期(處理后第10天)添加MeJA對細胞影響較大，可在短期內(nèi)獲得較多的β-EC，但存在時間較短，細胞反應劇烈，迅速衰老。

3 討論與結論

本研究發(fā)現(xiàn)，筋骨草細胞在培養(yǎng)的初始階段，細胞增殖速度較慢，隨著時間的延長而轉變?yōu)榭焖僭鲋?，到達高峰后趨于穩(wěn)定狀態(tài)。β-蛻皮甾酮(β-EC)含量積累曲線也基本符合此規(guī)律。該研究結果與其他種類的筋骨草懸浮細胞生長規(guī)律基本一致[13-14]。另外，王文星等[20]發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒(Stellerachamaejasme)懸浮細胞的生長以及黃酮的積累隨培養(yǎng)時間的增加而增加，基本符合“S”型。丹參(Salviamiltiorrhiza)、黃岑(Scutellariabaicalensis)懸浮細胞生長量曲線亦是如此，呈“S”形曲線變化[21-22]，符合Logistic模型變化規(guī)律。

MeJA對植物細胞有多方面的功能。它可激活植物細胞體內(nèi)防御酶的活性[23-27]，促進細胞的分裂和增殖，調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育[17-18]。王保軍等[28]和Sirvent等[29]向貫葉連翹(Hypericumperforatum)懸浮細胞中添加100 μmol·L-1MeJA后，其生長量是對照的1.3倍，較低和較高濃度的MeJA對貫葉連翹生物量的影響不明顯。說明只有適量濃度的MeJA才會對細胞的生長量有促進作用。這與本研究的結果規(guī)律是部分相似的，不同的是在本研究中，100 μmol·L-1以上的MeJA對筋骨草細胞的生物量起抑制作用。在徐曲毅等[30]對綠豆(Vignaradiate)下胚軸生長的研究中，10-6～10-4mol·L-1以上的MeJA抑制綠豆下胚軸生長，這與本研究結果的表現(xiàn)是一致的。張進杰等[31]發(fā)現(xiàn)高濃度MeJA會抑制黃芩細胞的生長，而過早加入誘導物，細胞生長也會受到抑制[32]。這一觀點與本研究結果一致，說明細胞的抑制作用受誘導物添加時期、濃度等因素的影響。同時，本研究發(fā)現(xiàn)MeJA可縮短匍枝筋骨草懸浮細胞的生長周期，加速其成熟、衰老。東方百合種球(Liliumoriental)經(jīng)過1.0和10.0 mg·L-1MeJA處理后，可導致始花期顯著提前。而在東方百合生長的現(xiàn)蕾期噴施1.0 mg·L-1MeJA可使單株花期和群體花期分別延長2.09和3.25 d[33]。在本研究中，細胞快速生長的初始期(第4天)添加50 μmol·L-1MeJA后筋骨草細胞鮮重持續(xù)增加，在添加后第7天達到最高值35.10 g，而在細胞快速生長的高峰期(第10天)添加50 μmol·L-1MeJA后第1天細胞生長就受到抑制，逐漸衰老死亡。說明不同的時期添加MeJA可調(diào)控植物的生長[34-35]，本研究結果與此基本一致。

MeJA作為細胞間傳導的信號分子，可刺激植物啟動防御體系，從而增加多種次生代謝物質(zhì)、揮發(fā)物的產(chǎn)量[36-38]。謝陽姣等[39]發(fā)現(xiàn)苦玄參(Picriafelterrae)經(jīng)過 0.05 mmol·L-1的MeJA處理后，對代謝產(chǎn)物苦玄參苷 IA 和苦玄參苷 IB 的積累均表現(xiàn)為促進作用，這與Aftab等[40]的MeJA可提高植物中青蒿素產(chǎn)量的觀點相似。苗曉燕等[41]發(fā)現(xiàn)當MeJA濃度達400 μmol·L-1時，珊瑚菜(Glehniabolittoralis)的干燥根中補骨脂素和異歐前胡素含量可達到最大值，分別為CK的6.09和5.53倍。 這說明MeJA可以刺激多種次生代謝產(chǎn)物的大量產(chǎn)生。朱宏濤等[42]發(fā)現(xiàn)，三七(Panaxnotoginseng)組培苗中總苷含量隨著培養(yǎng)時間延長總體呈先升后降趨勢，MeJA濃度不同，總苷最高含量出現(xiàn)的時間也不一致，低濃度出現(xiàn)時間晚，高濃度出現(xiàn)時間早。這與本研究的結果基本相似。在本研究中，代謝產(chǎn)物β-EC積累量也呈現(xiàn)先升后降趨勢，隨著處理時間的延長，添加高濃度MeJA的細胞最先達到積累高峰，之后快速衰老死亡。蔡靜等[43]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)周期第10天(指數(shù)生長中期)加入100 μmol·L-1MeJA對明黨參(Changiumsmyrnioides)懸浮細胞作用效果最明顯，而最適收獲時間為處理4 d后，此時懸浮細胞中佛手酚的產(chǎn)量為未誘導細胞的73.6倍。在本研究也發(fā)現(xiàn)類似結果。同時，王和勇等[44]發(fā)現(xiàn)不同植物的代謝產(chǎn)物對誘導子的敏感程度不同，因此不同代謝產(chǎn)物的積累與合成還需進一步研究探討。

本研究表明，筋骨草細胞的生長、β-EC積累動態(tài)曲線呈“S”型，符合Logistic規(guī)律。其中4～10 d是細胞生長、β-EC合成的關鍵時期。此期細胞鮮重最高為32.12 g，干物質(zhì)積累達0.58 g，細胞中β-EC達到0.25 mg·g-1。在生長周期內(nèi)細胞生長和β-EC的合成幾乎同步，表明筋骨草細胞在生長過程中不斷積累β-EC類物質(zhì)，細胞生長的速度與β-EC的合成密切相關。在筋骨草細胞的不同生長時期添加MeJA對細胞鮮重、β-EC的積累量影響有所不同，而β-EC總含量與β-EC的積累量規(guī)律相似，同時，三者還與添加濃度、處理時間等因素相關。試驗發(fā)現(xiàn)，在細胞生長的初始期添加MeJA后對細胞影響最小，表明在細胞生長的初期可能對MeJA類物質(zhì)并不敏感，雖可刺激一定量的β-EC產(chǎn)生，但存留時間較短。在此時添加MeJA，細胞中β-EC的含量和培養(yǎng)體系中所有細胞中β-EC總量的最大值均出現(xiàn)在添加100 μmol·L-1MeJA后的第3天，分別為2.7766 mg·g-1和0.7868 mg。而在細胞生長的中期(第7天)添加100 μmol·L-1MeJA后的第7天，細胞中β-EC含量和所有細胞中β-EC總量的最高值均出現(xiàn)在添加后的第7天，分別達到3.5315 mg·g-1和1.2124 mg，此時積累量達到了本研究所有處理組中β-EC總量的最高值，是同期CK的14.44倍。在此期，添加更高濃度MeJA后，也可以在短時間內(nèi)刺激懸浮細胞產(chǎn)生大量β-EC。如：在第7天添加150 μmol·L-1MeJA處理后1 d，細胞中β-EC含量可達1.4986 mg·g-1，培養(yǎng)體系中所有細胞的β-EC總量達0.5244 mg。在細胞生長的后期添加MeJA主要表現(xiàn)為抑制細胞的生長，促使生長周期縮短，加速細胞衰老，只有很低劑量的MeJA能在添加后的短時間內(nèi)促進一定量的β-EC產(chǎn)生。如：在此期添加10 μmol·L-1MeJA后的第3天，細胞中的β-EC含量達1.4136 mg·g-1，培養(yǎng)體系中所有細胞中β-EC總量達0.5889 mg。